作者： 童 蒙
编辑：amethyst
可变剪接作为转录后修饰的重要环节，对细胞的活性和疾病的发生发展都有广泛的作用。尽管目前软件很多，但是软件间的比较却比较少。作者系统地比较了10款软件，利用了一致性（consistency）、可重复性（reproducibility）、精确度（precision）、召回率（recall）和错误发现率（false discovery rate）、报道的可变剪接基因的一致性（agreement upon reported differentially spliced genes）与功能富集分析一致性等方面来评价不同的可变剪接软件。
软件主要是三大类：
- exon-base ：DEXseq、edgeR、JunctionSeq、limma
- isoform-base：cuffdiff2、diffSplice2
- event-base：dSpliceType、MAJIQ、rMATS、SUPPA
结论
- 所有exon-base的软件 要好于其他两个
- 数据集和样品数对结果的影响更大
一、研究背景
在人类中，90%-95%的exonic基因存在可变剪接；不同的可变剪接也可以作为药物的biomarker或者target。
可变剪接类型主要有五种：
SE：是高等生物中比较常见的事件，能占到40%；
A3SS：3'端选择不同的剪接位点，占18%左右；
A5SS：5‘端选择不同的剪接位点，占8%左右；
RI：内含子保留，比例大概为5%；
MXE：外显子互斥的可变剪接。
可变剪接的检测策略
isoform-base : 先构建全长转录本和定量，再来做差异分析
count-base：将基因用单个统计单元来表示，并且进行差异分析
- exon-base ：利用exon来作为统计单元
- event-base ：利用junction region作为统计单元
文章使用的参比数据
human prostate cancer：人类的前列腺癌的数据，28个样品；
human hepatocellular carcinoma ：肝癌数据，100个样品；
MVS， mouse validated data，敲除小鼠的转录本，包含验证过的28个基因；
HVS， human validated data，32个验证过的基因。
二、材料方法
1、各个软件说明
isoform base
- cufflinks：首先构建overlap graphs，之后估计转录本丰度，最后检查差异基因和isoform；
- DiffSplice：基于图论的方法来进行分析，首先基于比对构建转录本，然后对不同的path来定量丰度，最终鉴定出可变剪接体。
count base
- exon-base：将序列分配到不同的特征上，例如exon或者junction；这个只能分析已知的特征，而不能推断出新的可变剪接事件；
- isoform-base：通过计算每个事件(PSI)值中的拼接百分比来量化剪接事件，PSI表示该值测量从包含该事件特定形式的基因中表达的mRNA的分数。
2、数据来源
4个下载的数据
软件的详细信息
3、评估方法
针对PCa和HCa数据集
- 一致性：使用gene层面上的结果，来评估一致性。
-
precision ：部分样品与全部样品的交集 比上 部分样品检测的结果
-
recall：部分样品与全部样品的交集 比上 所有样品检测的结果
- FDR：从正常样品中抽样产生模拟的两个组进行比较，得到的基因作为FP；FDR=FP/(相同样品数下的差异数)。
针对MVS和HVS数据集
- 检测率：对28和32个qPCR验证的基因进行比较；
- 不同深度：使用HVS，采样到20-100M，进行分析。评估precision和recall。
功能分析
- 使用top500 genes，利用topGO进行功能分析。
三、结果
1、检测数和一致性
检测数方面
- 在PCa和HCa中，发现不同的工具检测出来的数据变化很大：
PCa中cuffdiff为0 ， edgeR为4506个；HCa中SUPPA2为0，而limma为14313个 - cuffdiff2检测结果最小；SUPPA也检测不多；
- exon-base的方法变动随着样品增加变化大；
- 在有些软件中，检测的差异数随着样品增加而增加，有些软件却减少
precision方面
随着样品数不一样，整体变动大
exon-base的方法的precision高于其他两种
FDR方面
使用normal样品作为两组来进行DS检测。各个软件差异蛮大，有些FDR还很大
2、交并集比较
相关性分析：取每个工具前500个基因进行相关性分析，发现相关性很差。
不同的软件报道的事件也有偏差。
3、qPCR结果的比较
使用真集来验证precision和recall。惨不忍睹。
4、功能分析
作者做了功能分析，想从功能分析找补回来，看看功能是不是一样。
5、资源消耗
从不同的样品数进行了评估。
6、测序量的作用
大概在40-50M的时候，发现量就稳定了
7、DS基因与DEG基因的关系
做了两个列表的交集，发现关系不大。
四、总结
文章亮点
- 选择了10个软件，代表不同的算法
- 使用了较大的数据样品，数据量也够，也有qPCR结果
下一步方向
- 没有全面的ground truth
结论
- exon-base和两款event-base的方法表现好
- 建议多用几款软件
五、参考文献
Mehmood A, Laiho A, Venäläinen MS, McGlinchey AJ, Wang N, Elo LL. Systematic evaluation of differential splicing tools for RNA-seq studies. Brief Bioinform. 2020 Dec 1;21(6):2052-2065. doi: 10.1093/bib/bbz126. PMID: 31802105; PMCID: PMC7711265.
