摘要

随着对人类疾病的分子理解不断加深和基因传递技术的不断改进，临床基因治疗取得了越来越多的成功。其中，基于腺相关病毒（AAV）的递送载体已被证明是安全和有效的，甚至在最近的一个案例中获得了监管机构的批准。虽然病毒载体的特性限制了将这种疗法扩展到许多其他人类疾病，但通过新的工程和改进AAV载体及其遗传载体的方法，越来越多的障碍得以克服，为提供改进的治疗选择打开了新的可能性。

引言

目前全球有大约7,000种单基因遗传疾病，给数百万人带来了严重的个人和社会后果，而其中绝大多数疾病目前还没有有效的治疗方法。然而，随着下一代测序技术的快速进展，已经成功鉴定出约50%的这些疾病对应的基因，而其余部分预计在未来十年内也将被找到。与此同时，基因治疗领域克服了许多安全和高效基因递送的难题，为一些单基因疾病提供了前所未有的治疗机会。此外，基因治疗在一些复杂疾病中也显示出成功的迹象，如心脏病、神经退行性疾病、中风和糖尿病等慢性疾病。将疾病遗传学和病理学知识与有效的基因治疗相结合，为单基因和复杂人类疾病开发出单次治疗方案，有望彻底改变医疗保健的模式。

截至目前，基因治疗的成功主要得益于发现了几种可用于改造成有效基因传递载体的病毒，其中包括无致病性的腺相关病毒（AAV）（图1）。特别是使用AAV载体进行的越来越多的I期至III期临床试验取得了令人鼓舞的结果。例如，在家族性脂蛋白脂酶（LPL）缺乏症的试验中，采用基于AAV1的载体编码功能增强变体LPLS447X，导致持久的基因表达和蛋白活性，从而持续降低了胰腺炎的发病率。基于这些结果和其良好的安全性，这一产品名为Glybera（alipogene tiparvovec）在2012年获得了欧洲联盟的市场批准，尽管是在“特殊情况”下（请参见EMEA网站，https://www.ema.europa.eu/en/documents/product-information/glybera-epar-product-information_en.pdf）。此为西方国家首个获得批准的基因治疗产品。AAV载体在其他单基因疾病中也显示出安全性和有效性，包括先天性黑蒙症2型、无脉络膜症和血友病B等疾病。与此同时，AAV还被应用于特发性疾病的治疗。例如，通过给予携带SERCA2a基因的AAV1载体治疗，改善了晚期心力衰竭患者的多个关键指标。因此，基因治疗在孟德尔遗传疾病和复杂疾病方面显示出越来越多的潜力。

然而，在基因治疗领域中，有效传递遗传物质一直是一个重大挑战（方框1），因为许多治疗适应症的递送需求与病毒载体的天然传染特性不匹配。为了克服这些障碍，已经采用了一些创新的方法。例如，对AAV（腺相关病毒）外壳结构的认识不断提高，促进了对AAV外壳的合理设计，而AAV外壳库的开发和筛选方法的发展则有助于有针对性的改进AAV外壳。此外，虽然迄今为止基因治疗在基因替代治疗隐性遗传疾病方面取得了主要成功，但随着治疗载荷的进展，很快也可能实现对显性遗传疾病的治疗。

BOX 1 AAV基因传递和疗效的挑战

免疫相互作用
免疫系统在阻止外源核酸的传递方面是非常有效的，免疫系统对于外源核酸的传递非常有效，这给基因治疗带来了许多挑战。广泛的自然AAV接触导致大部分人群体内存在中和AAV外壳抗体，存在于血液和其他体液中。此外，在细胞转导后，AAV外壳表位可能会在MHC I复合物上进行交叉呈递，导致特异性靶向外壳的细胞毒性T淋巴细胞消除被转导的细胞，进而导致基因表达的丧失，正如早期血友病B临床试验中观察到的因子IX表达下降所示。许多人CD4+和CD8+T细胞表位已经被鉴定为针对AAV2和AAV8，而MHC基因座是人类基因组中最多态性的之一，这使得设计出一种能够逃避所有可能的MHC组合识别的AAV外壳变得困难。然而，有可能通过工程手段设计出不容易被蛋白酶体或与抗原处理相关的转运蛋白(TAP)处理的AAV外壳。

对靶细胞的转运和趋化
针对系统性给予的病毒而言，肝脏通常是默认的目标，但当其他器官是预期的目标时，这可能会构成一个障碍。此外，一些组织中的内皮细胞层，特别是在血脑屏障内，会形成物理屏障，阻碍病毒进入。当病毒进入某个器官时，它可能会面临多个传输障碍，这会限制其对通常较大的组织体积进行高效的基因转导。这些传输障碍包括细胞外基质和细胞内部的障碍，以及细胞之间的结构和连接方式。在这些障碍中，许多AAV变体可能会与特定分子相互作用，如肝素硫酸盐，从而影响其在组织中的扩散和传输能力。

细胞屏障
一旦载体抵达目标细胞表面，可能会缺乏与载体结合和内化所需的主要和/或次要受体。此外，逃脱内质网、逃脱蛋白酶体、进入细胞核以及载体解包装等过程都代表着基因转导的障碍。

包装容量
天然的腺相关病毒（adeno-associated viruses，AAV）具有一个单链的4.7 kb DNA 基因组。已经证明，基于AAV的基因传递载体能够以接近天然滴度和感染能力包装长达约5 kb的基因组，超过这个长度，包装效率显著下降，且会导致5'端截短的基因组被封装。

这篇进展文章重点介绍了载体工程领域的最新创新，特别是对腺相关病毒（AAV）变体的合理设计和定向进化，以及修改遗传载荷的新方法。我们讨论了几种成功应用的载体工程策略，这些策略创建了新型AAV变体，旨在克服AAV介导的基因传递面临的一些当前挑战，这些策略中尤其是针对壳蛋白工程的定向进化方法。

改造传递系统

在利用AAV进行基因传递时面临的挑战（见方框1）源于一个简单的事实，即自然病毒感染成功所需的特性与大多数医学应用所需的特性是不同的，因为病毒并非为后者而进化。然而，通过载体工程，我们可以解放使病毒摆脱自然进化的限制，从而获得新的、在生物医学上具有价值的特征。这种载体工程的发展可以分为两个主要方向：合理设计和定向进化。

AAV变体的合理设计

在某些情况下，对递送机制的了解以及AAV结构分析可以促进载体的改进。例如，研究人员发现，对AAV颗粒中的衣壳酪氨酸残基进行磷酸化会导致其被泛素化并促使其通过蛋白酶体降解。这一发现推动了通过定向突变将酪氨酸突变为苯丙氨酸的方法来改进载体。在一项研究中，这些改进的载体在体外的转基因表达水平提高了10倍，并在体内实现了高达30倍的转基因表达水平。最近，利用这种方法成功地改造出一种新型AAV2(Tyr-Phe)突变型衣壳，该突变型衣壳具有潜在的降低细胞毒性T淋巴细胞免疫反应风险的特性，而这正是临床应用AAV介导的基因治疗面临的一个主要限制（参见方框1）。具体而言，通过将酪氨酸突变为苯丙氨酸，研究人员发现这些突变体在体外可实现高达10倍的转基因表达，在体内可实现高达30倍的转基因表达。这是因为这些酪氨酸突变影响了衣壳的蛋白酶体降解过程，从而可能降低了衣壳抗原通过MHC I类呈递的过程，而这个过程通常始于细胞质中蛋白的蛋白酶体降解。

针对预先存在的中和抗体（参见方框1），也已经采取了合理设计的方法来解决这些挑战。绝大多数人类已经自然地接触过AAV，并且自然AAV变体和血清型之间存在相当大的序列相似性。因此，相当一部分人类携带有中和抗体，这些抗体极大地限制了许多自然载体（AAV2：72%、AAV1：67%、AAV9：47%、AAV6：46%、AAV5：40%和AAV8：38%）的基因递送能力。在大多数临床研究中，可以排除具有中和抗体的患者，解决这个问题，但需要进一步改进以扩大能从该疗法中获益的患者人群。为了发现和突变与抗血清型抗体结合有关的表位，采用了多种策略， 已经为几种抗体分析了负责中和抗体与AAV外壳结合的线性和构象表位。随后，Lochrie等人使用基于计算机模拟的结构分析方法，在AAV2表面中确定了与小鼠IgG2a抗体结合的可能结合位点，并对这些位点进行了广泛的定点突变，以开发出在体外对小鼠和人抗体中具有降低中和作用的变体。Mingozzi等人最近采用的另一种方法是生成基于AAV2的空壳颗粒，该颗粒发生了突变，使AAV与初级细胞受体的结合消失。当与携带治疗基因的重组载体混合时，这些空壳颗粒可以作为诱饵结合低至中等水平的中和抗体，从而增强小鼠和非人灵长类动物中共同注射的载体的转导能力，使其达到与未接触中和抗体的动物相等或更高的水平。

在另一个合理设计的例子中，将高亲和力配体纳入AAV外壳中可以使其与其他细胞表面受体结合，从而限制或重定向病毒颗粒。在最近的一项临床前研究中，Münch等人在AAV2外壳的VP2区域的N端插入了针对HER2受体的设计蛋白重复蛋白（图1），从而使载体在体外增加对HER2受体过度表达的肿瘤细胞的特异性约30倍，在体内增加约20倍。此外，通过对受体结合相关区域的了解和结构比对，可以实现病毒靶向性的改变。例如，Shen等人利用定点诱变技术将负责AAV9结合的氨基酸与AAV2外壳中相应位点的半乳糖残基结合在一起。设计出双糖结合的AAV载体，能够同时利用肝素硫酸盐和半乳糖受体进入细胞。由于具备这种双重受体结合能力，该载体在肝脏中的感染能力显著高于AAV2，并且比AAV9对肝脏具有更高的特异性。

然而，在许多情况下，对于特定基因递送问题，对病毒结构-功能关系的了解还不足以实现有目的性的设计AAV复杂病毒颗粒。为了解决这一困境，近年来出现了一种方法，即定向进化，它模拟了自然进化的过程。

AAV变体的定向进化

定向进化策略利用遗传多样性和选择过程，通过逐步积累有益突变来改善生物分子的功能（Box 2，图2）。在该过程中，野生型AAV capsid基因通过多种方法进行多样化，形成大规模的基因库，并将其包装成病毒颗粒的库，然后通过选择压力筛选出能够克服基因递送障碍的新变体（Box 2）。重要的是，定向进化这种方法不要求了解基因递送问题的具体机理，因此可以加快改进载体的开发速度。

BOX 2 衣壳改造中的定向进化原理

文库构建方法

易错 PCR
为了生成基因库，常用的方法是低保真度聚合酶链式反应（PCR），也称为易错PCR。易错PCR可以在AAV cap ORF中引入随机的点突变，其引入突变的速率可以事先确定和调整。这一方法可以对AAV的外壳蛋白进行一些变化，尽管引入的点突变数量相对较少。此外，易错PCR还可以与其他突变策略结合使用，以进一步优化所需的变体。

嵌合衣壳
通过体内病毒重组技术或更常见的DNA重组，可以产生AAV外壳基因的随机嵌合体，从而生成由多种血清型组成的嵌合体外壳基因库。这些“繁育出的”壳体可以以新颖的方式结合其亲本属性。然而，许多变异壳体可能无法进行包装，这大大减少了库中的多样性。

随机肽段插入
随机肽序列可以插入到病毒壳体的特定位点，例如AAV2壳体的肝素结合域以及通过将简并寡核苷酸连接到壳体开放阅读框中的AAV。随机肽的插入可能会将AAV载体对新的细胞表面受体的结合转移。相反，可以通过转座子突变将特定的肽编码序列插入到AAV2壳体开放阅读框的随机位置。

表面环状结构的随机化
多样性也可以集中在AAV壳体的多个高度可变区域，这些区域位于表面暴露的环状结构上。例如，我们生成了一种称为“环交换”的肽序列库。在这个过程中，我们将AAV2的四个表面环状结构替换。这些替换的肽序列是通过生物信息学设计的，它基于自然AAV血清型和变种中每个氨基酸位置的保守性级别。与随机肽插入库类似，只有壳体的一小部分发生了突变，但这种方法可以与其他突变策略配对，从而修改整个壳体。

选择

亲和力柱分选
我们可以利用亲和柱来筛选出具有增强或降低与细胞表面蛋白结合亲和力的AAV变体，这种筛选过程通过洗脱不同部分以获取有改变的结合亲和力的变体。然而，尽管这种方式能够迅速挑选出具有新型受体结合亲和力或特异性的AAV变体，但它并未涵盖到感染路径中其他重要的环节，如细胞外或细胞内的物质转运。

体外细胞培养模型
当细胞培养模型能够模拟体内环境的关键方面，如抗壳体抗体的结合或气道上皮结构和极化时，使用从组织样本中分离出的原代细胞或模拟人体内细胞行为的永生细胞系进行体外选择策略，可以有效地创造结合效率增强以及特异性增强的AAV变体。因此，体外选择已经产生了针对一些细胞类型的改良AAV变体的开发，包括人类气道上皮，人类胶质细胞和人类胚胎干细胞。然而，这种选择策略并不能准确模拟完整的体内环境，例如免疫交互，器官生物分布，组织运输障碍，以及组织内其他细胞类型的存在。

体内模型
为了更准确地捕捉临床基因治疗环境，可以直接在动物模型中进行选择。AAV库可以通过各种给药途径进行给药，包括静脉注射，玻璃体内给药，或直接进行脑内注射。然后收集感兴趣的组织或细胞类型，进而筛选成功感染该目标的AAV变体。一个挑战是，产生的变体能够提高用于所选的动物的感染性，但这并不一定能提高人类细胞的感染性。可以利用人类异种移植模型来筛选能感染到移植人类细胞的AAV变体。然而，这种优势同样面临挑战。首先，由于宿主免疫功能缺失，所使用的模型并未包含完整的免疫系统。其次，在非人灵长类或人类的环境中，对特定人类目标细胞的特异性是未知的。

Genome recovery

腺病毒介导复制
为成功的病毒基因组提供在基因库中增加频率的机会，这是自然选择的内在特性。在多种体外选择实验中，腺病毒被用作辅助病毒，用以扩增已进入目标细胞核内的AAV载体。人腺病毒的挽救方法也被用于体内实验，以扩增已感染人肝细胞而非小鼠肝细胞的载体。这种策略在目标细胞对腺病毒超感染开放且易接触时，会非常有效。

PCR扩增
尽管此方法存在风险，可能仅筛选出那些局部存在于特定细胞或组织中而并未真正有效感染它们的基因组，但PCR在许多体内选择研究中，成功地实现了增强型AAV变体的扩增和回收。当目标细胞难以接触或对腺病毒感染不敏感，或者当使用具有复制能力的载体库可能引发生物安全问题时，这种策略显得非常适合。

定向进化首次被应用于解决中和抗体问题，几项有前景的研究报道了成功的例子，例如，产生出的AAV2变体可以在体内外承受比野生型AAV2显著更高的中和抗体水平。最近的研究涉及使用多个不同的人类抗-AAV抗体库作为选择压力进行多轮定向进化，也产生出了在体内外都能增强抗体逃避的新变体。具体来说，我们通过对几个对抗体结合起关键作用的氨基酸进行饱和突变(saturation mutagenesis)或者进行DNA重组，创建了AAV的变体，与AAV1（与AAV2相比为35倍）相比，需要高达20倍的体外浓度的人抗体库来中和。此外，这些变体的抗体中和特性也促使了体内转导效率的增强。具体来说，在接受了人源抗体的被动免疫的小鼠体内，这些变体的肝脏、心脏和肌肉转导率比AAV2显著提高。

另一方面，人们已经通过定向进化生成了AAV的突变型囊壳蛋白，使其能更有效和特异性地感染原本不易被感染的细胞类型。例如，工程师们已经成功地改造了载体，在体外实验环境中使人源气道上皮细胞的转导效率提升了100倍，神经干细胞的转导效率提升了50倍，人类多能干细胞的转导效率提升了3倍。更进一步，定向进化已越来越多地应用于体内模型，尤其是在体外培养不能充分模拟真实情况的场合，比如系统性基因传递或者是通过复杂组织进行载体传输。Yang等人针对小鼠肌肉的更高效感染进行了体内的生物筛选，结果生成的一种嵌合变异型外壳在心脏的感染效率与AAV9几乎相等，但在肝脏的定位上明显减少，这种差异在统计学上具有显著意义。此外，Gray等人还分离出一种AAV8变体，这种变体能够穿透由于癫痫引发的血脑屏障损伤，进入大脑的某些区域。更近期，Lisowski等人采用了一种涉及免疫缺陷小鼠的模型，这些小鼠携带人类肝细胞异种移植物，以更好地模拟体内人类肝细胞感染。在给予了一个嵌合AAV库后，他们添加了人类腺病毒（具有对人类细胞的趋向性）来诱导所需AAV变体的复制，从而产生能够有效且选择性地进行人类肝细胞转导的AAV变体。未来的研究可能会将这些研究扩展到大型动物模型中，尤其是非人类灵长类动物。

基因治疗的临床应用也面临着病毒感染的组织传输障碍这一关键限制（参见图1）。举例来说，在视网膜疾病中最受影响的细胞 —— 视网膜感光细胞和视网膜色素上皮细胞 —— 都隐藏在数百微米厚的密集组织之后。视网膜下注射与玻璃体腔内注射相比存在手术风险，并且无法感染整个视网膜。因此，Klimczak等人通过工程技术研发了一种AAV变体，该变体通过玻璃体腔内注射，可以高度特异性（94%）且高效地感染遍布全视网膜的Müller细胞。在一种视网膜色素变性的大鼠模型中，使用这种工程化的AAV变体转导这些细胞，从而广泛地表达了一种神经保护因子，减缓了视网膜退化的速度。在近期的一项研究中，Dalkara等研究者运用体内定向进化技术开发出一种AAV，该AAV能够在玻璃体腔内注射后，将遗传物质运输至视网膜并直接感染感光细胞。这种经过改造的变种在小鼠和非人类灵长类动物体内，能在感光细胞中实现大幅度的基因表达增加，进而成功救治了患有X-linked retinoschisis和Leber's congenital amaurosis type的小鼠模型。

通过在各种体内外系统中的成功运用，定向进化已展示出克服广泛基因传递挑战的强大能力。未来的研究可能将更深入地融合对衣壳结构的理解，以及DNA合成和测序的先进技术，进一步提升这一技术平台的性能。除了开发改进的载体外，对于遗传负载的深入研究也将进一步拓宽基因治疗的应用领域。

工程遗传有效载荷

AAV介导的基因疗法需要面对两个额外的挑战：一是治疗常染色体显性遗传疾病，这种情况下需要去除而不是增加一个等位基因；二是在某些情况下，AAV的基因负载能力（4.7 kb）有限。我们可以通过改变遗传负载，而非病毒壳体，来解决这些问题。特别是，随着特异性序列内切酶（包括ZFNs、TALENs，以及CRISPR-Cas系统）的不断涌现，我们可能找到解决这些挑战的创新办法。内源基因修复一直是基因疗法的重要目标。序列特异性的内切酶可以提高有缺陷的等位基因与供体DNA之间的同源重组效率。例如，在一种血友病B的小鼠模型中，Li等人使用携带针对F9基因（编码凝血因子IX）的ZFN的AAV8载体来引发基因组中的双链断裂，以此促进与同时输入的、无启动子的凝血因子IX cDNA片段进行同源重组。实际上，这样产生的基因修复足以改善血液凝固时间，这提出了一种可能性：即使是对AAV来说过大的cDNA片段也可能被用于修复如肌萎缩蛋白、CFTR、CEP290、ABCA4、MYO7A、USH2A和F8（编码凝血因子VIII）这些大型内源基因中的局部突变。此外，尽管RNA干扰已经应用于特异性敲减致病等位基因，但通过AAV投递的目标DNA结合蛋白或核酸酶可能实现更有效的转录抑制，甚至彻底地敲除这些致病基因。虽然我们还需要进行更多的研究，以揭示这种方法对非目标位点可能产生的基因毒性，但是结合使用创新的载体和有效的载荷，将有可能进一步扩大基因治疗的应用范围。

结论

AAV对易接触组织的临床投递已经成功地治疗了一些隐性单基因疾病，这为该领域注入了巨大的动力。然而，我们仍需要面对药物投递和药物载荷的巨大挑战。幸运的是，像许多生物分子一样，病毒具有极高的可塑性。通过工程技术和进化策略，我们可以设计和定制具有针对性治疗需求特性的载体，这可能会将更多的治疗目标纳入AAV的覆盖范围。此外，新的荷载开发，特别是位点特异性DNA内切酶，为我们提供了进行基因修复甚至治疗显性遗传疾病的可能性。随着人类疾病生物学、AAV病毒学、工程技术和治疗荷载的最新进展，我们有望将临床成功扩展到更多的单基因和复杂疾病。