右击，选择View as pairs，右击选择Color alignments by，选择read strand
发现：双末端测序中两条reads的颜色只是为了区分在基因组中位置的先后，蓝色并不代表Second in pair，红色并不代表First in pair。红色表示比对到了DNA双链中上面这条链，即正链，注意不是正义链，蓝色表示比对到了DNA双链中下面这条链，即负链
从右向左转录的基因，First in pair往往是左面这条reads，Second in pair往往是右面这条reads；
从左向右转录的基因，First in pair往往是右面这条reads，Second in pair往往是左面这条reads。
也就是说双末端测序，第一次测得是反义链，第二次测得是正义链。这应该就是链特异性建库。
参考文章：从IGV的可视化结果看链特异性建库 - 简书 (jianshu.com)
1. 再看Htseq计数时，-s参数的选择
htseq-count -s reverse/yes(看反义链)
1.1 no
For stranded=no, a read is considered overlapping with a feature regardless of whether it is mapped to the same or the opposite strand as the feature.
如果选择no，不管方向如何，只要在这区间都会认为是这个基因。如果两个基因转录方向相反，而又有部分区域重叠，这种方法就认为比对到这个区域内的这部分reads是__ambiguous，选择默认参数的话就不会统计。所以不够准确。
1.2 yes
For stranded=yes and single-end reads, the read has to be mapped to the same strand as the feature. For paired-end reads, the first read has to be on the same strand and the second read on the opposite strand.
如果选择yes，单末端测序，reads必须与该feature的转录方向相同，双末端测序，第一条reads必须与feature的转录方向相同，第二条reads必须与feature的转录方向相反
1.3 reverse
For stranded=reverse, these rules are reversed.
如果选择reverse，单末端测序，reads必须与该feature的转录方向相反，双末端测序，第一条reads必须与feature的转录方向相反，第二条reads必须与feature的转录方向相同。
最后谈谈正链和正义链。
正链一般是固定的，DNA双链中上面这条链就是正链（+）。
正义链是相对的，它是依据基因的转录方向看的，向右转录（👉）的基因，正链即是它的正义链或有义链或非模板链，向左转录（👈）的基因，负链即是它的正义链。
