文章题目：Programme of self-reactive innate-like T cell-mediated cancer immunity
发表时间及期刊：2022年4月20日发表在Nature期刊
影响因子：2020/2021: 49.962
单位以及作者：美国纪念斯隆凯特琳癌症中心李明教授团队
主要内容：在小鼠乳癌模型（PyMT）发现一种新型细胞先天性杀伤型 T 细胞（Killer Innate-like T cell， ILTCK）。
这类细胞的特点：
1. 和传统 CD8 T 细胞一样都表达 T 细胞受 体 （T cell receptor，TCR），但其激活不依赖树突细胞（Dendritic Cell，DC），此特性使其更接近先天性淋巴细胞（Innate lymphoid cell）。
2. 不同于传统 CD8 T 细胞，ILTCK 不表达 PD-1 和其他免疫抑制受体，因此不会进入细胞耗竭状态，反而对肿瘤细胞有更强大的细胞毒性（cytotoxicity）。
3. 大部分的传统 T 细胞识别肿瘤新抗原，而 ILTCK 识别肿瘤原生抗原，并且具有显著的组织驻留性（tissue residency）。
研究结果：
1. ILTCKs有一个独特的转录组
为了研究肿瘤浸润性T细胞之间的异质性，我们对来自MMTV-PyMT(PyMT)小鼠乳腺肿瘤组织的CD45+TCRβ+CD8α+细胞进行了单细胞rna测序(scRNA-seq)分析，得到5个不同的簇。主要的marker基因如下：
进一步的进行轨迹推断，我们观察到初始/最近激活的(C1)细胞和耗尽的(C2)细胞之间的大量混合(图1d，e)，反映了由慢性刺激驱动的表型变化。相比之下，αβILTCKs（C3）和增殖（C5）细胞与C1分离的距离更远（图1d，e）。在校正了“细胞周期效应”后，最近激活向αβILTCK过渡的假设轨迹仍然与最近激活到耗尽的T细胞分化途径不同(扩展数据图2a，b)。因此，C1细胞要么通过一种独特的分化途径产生C3细胞，要么不是它们的祖细胞。高表达αβILTCK基因特征的肿瘤浸润性c3样CD8α+T细胞簇在PyMT乳腺肿瘤和小鼠前列腺癌模型(扩展数据图2c-h)以及人类结直肠癌4(扩展数据图2i-k)中重复存在，共同表明αβILTCK分化程序代表了一种进化上保守的肿瘤引起的免疫反应。
2. ILTCKtcr可以识别未突变的肿瘤抗原
为了探究肿瘤驻留的NK1.1+CD8α+αβILTCKs与传统的PD-1+CD8α+T细胞(PD-1+T细胞)有何不同，我们获得了每个子集使用的配对tcr序列的图谱(扩展数据图3a，补充表1)。然而，来自NK1.1+αβILTCKs和PD-1+T细胞的TCR之间的互补决定区3(CDR3)长度相似(扩展数据图3b)。值得注意的是，我们没有检测到NK1.1+αβILTCKs和PD-1+T细胞所使用的任何TCR对，这表明它们不是由一个共同的祖细胞发展而来的。
为了确定每个亚群的TCR的特异性，我们使用改进的TCR报告检测系统对它们对原发性PyMT癌细胞进行了反应分析(图2b，扩展数据图3c，补充表2)。33个NK1.1+αβILTCK衍生的tcr中有26个（78.8%）对异源癌细胞表现出显著的反应性(图2c)【怎么得到的表】，表明它们识别来自多个小鼠的癌细胞共享的未突变抗原。相比之下，没有一种PD-1+T细胞来源的TCR的反应超过了无关的OT-ITCR建立的背景水平(图2c)，这意味着它们对个体肿瘤特异性新抗原有反应。
当癌细胞缺乏经典的主要组织相容性复合体I类(MHC-I)编码基因（H2-K1和H2-D1）或所有MHC-I分子的专性亚基B2m时，这种反应性丧失。这表明αβILTCKtcr与它们的CD8+T细胞一样，主要局限于经典的MHC-I。
为了测试αβILTCKTCR是否识别MHC-I分子，而不管肽序列，我们使用PyMT肿瘤来源的癌细胞系缺乏内质网肽转运体TAP1，因此具有几乎无法检测到的表面MHC-I水平(扩展数据图4f)。Siinfekl肽稳定的MHC-I表达不足以激活αβILTCKTCRs(扩展数据图4g，h)，表明这些TCRs识别特定的肽-MHC-I复合物，而不是MHC-I分子本身。
3. ILTCKs are agonistically selected
为了研究传统的CD8+T细胞是否会产生NK1.1+αβILTCKs，我们在CD8+T细胞中将内源性重排的TCR替换为αβILTCK衍生的TCR(扩展数据图5a-e)。在过继转移到携带肿瘤的受体小鼠中(图2d)后，表达αβILTCK衍生TCR的CD8+T细胞显示PD-1表达上调，而NK1.1表达不上调(图2e，f，扩展数据图5f)。此外，传统的CD8+T细胞反应需要BATF3-和irf8依赖的传统1型树突状细胞(cDC1s)启动，而肿瘤内NK1.1+αβILTCK反应独立于cDC1s（扩展数据图6）。这些发现表明，αβILTCKs独立于次级淋巴器官中树突状细胞介导的启动，并具有与传统CD8+T细胞不同的本体论。事实上，在肿瘤中，表达αβILTCK衍生TCRs的胸腺细胞发育中，持续且特异性地产生NK1.1+αβILTCKs，而不是PD-1+T细胞(图2g-i，扩展数据图7a-c)。因此，NK1.1+αβILTCK和PD-1+T细胞代表了两种相互排斥的细胞命运选择，在胸腺细胞发育过程中，任何一种细胞系都可能以tcr特异性依赖的方式发生。
而具有多克隆TCR库的胸腺细胞主要产生常规的CD4或CD8单阳性T细胞(图3a，b)，而含有单克隆αβILTCKTCR的胸腺细胞只产生CD4-/loCD8-/lo细胞(图3a，b，扩展数据图7d，e)。到目前为止，所有已知的TCRαβ+T细胞在发育过程中都在胸腺中经历了CD4+CD8+双阳性阶段。与预期的一样，肿瘤驻留的NK1.1+αβILTCKs和PD-1+T细胞，而不是CD19+B细胞，被Rorc-cre等位基因一致定位，该等位基因在CD4+CD8+胸腺细胞中瞬时活跃(扩展数据图7f，g)。然而，与其他先天T细胞，如不变的自然杀手T(iNKT)细胞，由高表达的转录因子Zbtb，NK1.1+ αβILTCKs 没有命运映射Zbtb16-cre-Rosa26LSL-YFP等位基因(扩展数据图7h，我)，可能由于缺乏经典的MHC-I表达CD4+CD8+胸腺细胞。
经阳性选择后，CD4+CD8+胸腺细胞瞬时表达低水平的PD-1。相比之下，表达αβILTCK-TCR的胸腺细胞保持了较高的PD-1表达(扩展数据图7j，k)，表明其有强烈的TCR刺激的历史。事实上，33个αβILTCK衍生的TCR中有23个（69.7%）对胸腺上皮细胞皮系表现出大量的反应性，其水平超过OT-ITCR，驱动了传统CD8+T细胞的阳性选择(扩展数据图7l，数据未显示)。这些发现表明，强烈的自身反应性驱动αβILTCK谱系承诺，类似于指定iNKT细胞和肠道上皮内淋巴细胞(IEL)命运的“激动剂”选择过程。
为了区分造血间质和耐辐射基质间在介导αβILTCK选择中的作用，我们以野生型或B2m-/-小鼠为受体，生成了TCR-“逆转录”小鼠。B2m-/-受体的胸腺αβILTCK祖细胞室未改变（扩展数据图7m），但仅在造血室B2m消融轻度减少，B2m消融显著减少（扩展数据图7n）。因此，αβILTCKs的激动剂选择信号由辐射敏感的造血和抗辐射的间质室冗余提供。
4. ILTCKs continually repopulate tumours
不断地再生肿瘤
大量携带αβILTCK-tcr的胸腺细胞共同表达PD-1和CD122(扩展数据图7j，k)，这一表型让人联想到IEL承诺的胸腺祖细胞。事实上，表达αβILTCK肿瘤tcr的胸腺细胞除了瘤内αβILTCKs外，还分化为小肠IELs，两个群体都表达CD8αα同型二聚体(扩展数据图8a-c)。在过继转移到淋巴细胞减少的肿瘤小鼠，多克隆TCRβ+CD4-/loCD8-/loPD-1+CD122+胸腺祖细胞既产生瘤内αβILTCKs，也产生肠道IELs(图3c，d，扩展数据图8d，e)。然而，在淋巴细胞丰富的小鼠中，αβILTCK和IEL祖细胞移植到肿瘤中，而不是在小肠中(图3c，d)。为了进一步探索肿瘤内αβILTCK和肠道IEL再生的动态，我们使用了Fgd5-creER-Rosa26LSL-tdTomato等位基因，其中他莫昔芬脉冲标记了部分造血干细胞26，能够稳定跟踪其后代(扩展数据图8f)。在Lin−-KIT+SCA1+骨髓干细胞中，有20%的标记效率，大约3%的胸腺αβILTCK/IEL祖细胞被命运定位，类似于成年小鼠的CD4+CD8+、CD4或CD8单阳性和iNKT细胞室(扩展数据图8g-i)。相比之下，小肠CD8αα+IELs的标记能力可以忽略不计(扩展数据图8k，l)，证实了早期播种和原位增殖是其种群维持的主要手段27。因此，肿瘤内αβILTCK室，而不是肠道IEL室，不断由胸腺祖细胞补充。
5. FCER1G的表达标志着ILTCK谱系
为了深入了解ILTCK谱系的特征，我们将肿瘤浸润性NK1.1+αβILTCKs和PD-1+T细胞与其各自的胸腺祖细胞进行了比较(扩展数据图9a)。在αβILTCK祖细胞中上调但在成熟祖细胞中被抑制的基因在与抗原刺激相关的基因中富集，包括Tox-Pdcd1程序(扩展数据图9b，补充表3)，反映了激动剂选择事件。αβILTCK祖细胞中Lat和Cd2的下调可能会抑制TCR信号传导，使成熟的αβILTCKs不容易被耗尽(扩展数据图9c，补充表3)。值得注意的是，编码许多NK受体和信号分子的基因在αβILTCK祖细胞中表达上调(扩展数据图.9d，补充表3)，并在成熟的NK1.1+αβILTCKs8中保持高表达。相比之下，与末端效应分化和组织驻留计划相关的途径，包括Gzmc、Itga1和Itgae，可能是通过响应局部肿瘤微环境特异性信号而获得的(扩展数据图9e，补充表3)。
虽然承诺的αβILTCK祖细胞的过继转移持续产生NK1.1+αβILTCKs，但仍有相当一部分是NK1.1−细胞(图3c)。这不太可能是αβILTCK祖细胞之间预先存在的TCR异质性的结果，因为表达单克隆TCR的胸腺细胞也产生了NK1.1−和NK1.1+亚群(图2g-i，扩展数据图7b，c)。与PD-1+T细胞相比，NK1.1-细胞在转录上更类似于NK1.1+αβILTCKs(扩展数据图9f)，但它们在胸腺αβILTCK祖细胞中富集的转录本表达更高，包括Pdcd1（补充表4）。与终末效应分化相关的基因，包括Gzmc，在获得NK1.1时共同上调（补充表4）。因此，NK1.1标记激活了αβILTCKs，可能不能识别肿瘤中所有的αβILTCK细胞谱系。
scRNA-seq实验显示，在小鼠的癌症模型中，Fcer1g在转录定义的αβILTCK簇(C3)中存在差异表达(扩展数据图。1,9g，h)，并标记了一个在结肠直肠癌患者的肿瘤组织中与小鼠αβILTCKs转录相似的C3亚群(扩展数据图。2i–k, 9i).这些观察结果表明，Fcer1g可能是一个保守的αβILTCK谱系定义标记。事实上，FCER1G蛋白已经上调承诺PD-1hiCD122hi胸腺αβILTCK祖细胞，但不是在CD8单阳性细胞，并继续表达肿瘤浸润NK1.1+αβILTCKs而不是PD-1+T细胞(扩展数据图9j，k)，表明FCER1G具体和稳定标记细胞致力于αβILTCK血统。
在CD4−CD8α−TCRβ+CD1d−NK1.1−胸腺细胞中，FCER1G+CD122+群体表达高水平的PD-1，缺乏颗粒酶B(GZMB)表达，表型与CD122和PD-1共同表达的αβILTCK和IEL祖细胞相同(图4a，b)。在肿瘤浸润性T细胞中，FCER1G+CD122+群体仍然是CD4−，其中大多数上调CD8αα同型二聚体(扩展数据图9l，m)，并且一致缺乏PD-1的表达(图4a，b)。值得注意的是，FCER1G+CD122+T细胞中同时含有NK1.1+GZMB+/−αβILTCKs和它们未成熟的NK1.1−GZMB−前体(图4a，b)。因此，FCER1G的表达可以充分识别肿瘤浸润性αβILTCKs，而不管其激活状态如何。
在结肠癌患者中，FCER1G+TCRβ+细胞也很容易在肿瘤组织中检测到(扩展数据图9n)，其共受体表达谱与小鼠相似(扩展数据图9n，o)。FCER1G+T细胞相对于邻近的正常结肠在肿瘤组织中富集(图4c，d)，与PD-1+相比，它们表达了更高水平的GZMB(图4e)。总的来说，这些发现确定了FCER1G作为αβILTCK谱系定义标记，并证明αβILTCK程序在小鼠和人类中代表了一种进化上保守的肿瘤引起的免疫反应。
6.ILTCK可被设计用于癌症治疗
与之前的研究表明NK1.1+αβILTCKs严重依赖于促炎细胞因子IL-15相一致，我们在缺乏Il15的小鼠中观察到FCER1G+CD122+胸腺αβILTCK祖细胞几乎完全缺失(图5a，b)。因为IL-15在两者中都有表达淋巴组织和非淋巴组织，驱动肿瘤内αβILTCKs的扩张和激活的IL-15的确切来源尚不清楚。在造血细胞系中消融Il15并没有损害肿瘤引起的αβILTCK反应（数据未显示）。值得注意的是，与健康的乳腺组织相比，转化的乳腺上皮细胞中IL-15的表达明显增加(图5c)。IL-15在结肠癌患者的肿瘤上皮细胞中也很容易被检测到(扩展数据图10a)，而FCER1G+的频率，而不是PD-1+，T细胞与IL-15水平呈正相关(图5d，扩展数据图10a，b)。
为了研究癌细胞表达的IL-15是否调节αβILTCK反应，我们使用了S100a8-cre-Il15fl/flPyMT小鼠，这些小鼠中Il15在转化中缺失，但在健康的乳腺上皮中没有缺失(扩展数据图10c，数据未显示)。S100a8-cre-Il15fl/flPyMT小鼠的胸腺FCER1G+CD122+αβILTCK祖细胞水平相似(图5e，f)。值得注意的是，与对照组相比，S100a8-cre-Il15fl/flPyMT小鼠中肿瘤浸润性αβILTCKs明显减少，而残留的αβILTCKs中NK1.1和GZMB的表达明显减少(图5e，f)。值得注意的是，与野生型对照组相比，S100a8-cre-Il15fl/flPyMT小鼠表现出加速的肿瘤生长(图5g)。这些发现表明，ILTCKs可以感知癌细胞来源的IL-15，用于癌症免疫监测。
值得注意的是，IL-15足以在胸腺αβILTCK祖细胞中诱导NK1.1和GZMB的上调，以及伴随的PD-1的下调(扩展数据图10d)。为了测试异位激活IL-15信号是否在过继转移的αβILTCK祖细胞可以抑制肿瘤的发展，我们从Ubc-creER-Rosa26LSL-Stat5b-CA/+小鼠中纯化胸腺αβILTCK祖细胞，其中他莫昔芬诱导转录因子STAT5B(STAT5B-CA)的表达，主要协调IL-15信号下游的转录程序31(扩展数据图10e)。在过继转移到淋巴细胞缺陷的肿瘤携带PyMT小鼠后，STAT5B-CA的诱导表达导致转移细胞扩增60倍，四周内NK1.1和GZMB均匀上调(扩展数据图10f-i)。重要的是，与对照组αβILTCKs或无细胞转移的小鼠相比，接受STAT5B-ca武装αβILTCKs的小鼠表现出明显的肿瘤生长抑制作用(扩展数据图10j)。
当过继转移到充满淋巴细胞的PyMT宿主时，STAT5B-ca武装的αβILTCK祖细胞很容易定植肿瘤组织，并经历了强大的扩增和效应分化，导致肿瘤生长减少(图5h-j，扩展数据图10k)。相比之下，过继转移的STAT5B-ca武装的胸腺CD8单阳性T细胞没有移植或分化，可能是由于肿瘤反应性克隆的频率较低，并且预期肿瘤生长没有改变(图5h-j)。因此，αβILTCK中的IL-15信号轴可以成为开发癌症治疗方法的一个强大的和可利用的底物。
Discussion
在这项研究中，我们建立了FCER1G+αβILTCK程序，作为一种独特的和进化保守的肿瘤诱导的T细胞反应，并确定癌细胞来源的IL-15是其抗肿瘤作用的必要和充分驱动因素。由于FCER1G为多个NK受体提供了必要的激活基序，其在胸腺αβILTCK祖细胞中的早期表达可能增强其在肿瘤组织中NK受体上调时效应功能的快速获得。虽然FCER1G也特异性地标记了人类肿瘤浸润性αβILTCK样细胞的一个亚群，但在部分循环的人CD8+T细胞中，延长IL-15暴露可以诱导FCER1G32。可以想象，FCER1G的表达在人类αβILTCKs中可能比在小鼠αβILTCKs中更动态地调控。另外，FCER1G可能标记除人类αβILTCK之外的其他谱系，其解决方案需要进一步的研究。尽管广泛表达肿瘤反应性tcr，但il-15激活的αβILTCKs8的细胞毒性是不可必要的。
