一、包埋实验器材和试剂

1、试剂

酒精、苯醇、二甲苯、苯蜡、 纯蜡。

2、器材

镊子、解剖刀、解剖剪、包埋盒、洗脱瓶、酒精灯、冰、切片机、烘片机、浸蜡瓶。

二、步骤

1.取材

将舌鳎性腺从酒精中取出放在实验台上，用镊子夹住性腺的一端进行横切，取材长度2-3mm，放入包埋盒中脱水。注意编号

2.脱水

将包埋盒放入盛有酒精的洗脱瓶中按酒精浓度梯度脱水 

70%酒精（45min/1h）→80%酒精（45min/1h）→90%酒精（45min/1h）→100%酒精（40min）

3.透明

1:1苯醇（40min) →二甲苯（30min） 

4. 浸蜡（恒温箱62℃、1天）

1:1苯蜡（45min/1h）→纯蜡1（45min/1h）→纯蜡2（45min/1h）

包埋时间表：

步骤：

70%酒精（45min/1h）→ 80%酒精（45min/1h）→90%酒精（45min/1h）  → 100%酒精（40min）→ 1:1苯醇（40min)  → 二甲苯（30min）→  1:1苯蜡（45min/1h） → 纯蜡1（45min/1h）→纯蜡2（45min/1h）

5.包埋

用加热的镊子将材料放入包埋盒中，横切面向下，倒入熔融的石蜡，用加热的镊子迅速将材料按所需的切面摆放整齐，待包埋盒表面的石蜡凝固后将包埋盒平放入冰中，使石蜡迅速凝固。最后从包埋盒中取出蜡块，以便保存。将样品编号封于蜡块上，以免样品混淆。

6.修块

将已包埋好的含有包埋材料的蜡块用单面刀切成梯形小块，并可粗视到材料切面

7.切片

用切片机将蜡块切成连续的蜡带。切片时先把切片刀夹在刀架上，再把载蜡器夹在固定装置上（注意安装切刀的角度，刀口运行方向与材料切面平行），然后调整好所需厚度，5微米，转动切片机切片。

8.粘片

切下来的切片经过目检，将符合要求的切片粘在洁净的载玻片上。粘片时先在载玻片上涂上少量甘油蛋白（可用蛋青和甘油各50ml，加1g 水杨酸混合而成），加几滴蒸馏水，然后用镊子小心把切片放在水上，在40℃下，用拨针将切片伸直、展平，并烘干。

9.染色

见染色流程

切片染色流程

1、二甲苯Ⅰ        15min   

2、二甲苯Ⅱ        15min

3、1:1苯醇          5min

4、无水乙醇          2min

5、90%乙醇          2min

6、80%乙醇          2min

7、70%乙醇          2min

8、50乙醇            2min

9、30%乙醇          2min

10、自来水          2min

11、蒸馏水          2min

12、苏木素          10min

13、自来水          5min

14、蒸馏水          2min

15、盐酸分化液      5s

16、自来水          10min

17、蒸馏水          2min

18、30%乙醇        2min

19、50乙醇          2min

20、70%乙醇        2min

21、80%乙醇        2min

22、伊红            40s

23、90%乙醇        2min

24、95%乙醇        2min

25、无水乙醇Ⅰ      2min

26、无水乙醇Ⅱ      2min

27、1：1苯醇        2min

28、二甲苯Ⅰ        5min 

29、二甲苯Ⅰ        5min

10.树胶封片、镜检、保存

附：

· 固定的目的

1迅速阻止组织、细胞的死后变化，防止自溶与腐败，使之尽量保持生前的状态与结构。

2使细胞内的蛋白质、脂肪、糖、酶等成分转变为不溶性物质，以保持其原有状态。

3使组织内各种物质成分产生不同的折光率，以便染色后易于鉴别和观察。

4使组织块硬化，从而在脱水、包埋、切片、染色等过程中不易损坏。

5使组织成分对染料有不同的亲和力，经过染色处理后易于辨认。

6防止细胞过度收缩或膨胀而失去其原有形态结构。

· 固定的注意事项及影响因素

1固定液的用量

应充足，一般为组织块体积的10-20倍左右。瓶底垫上脱脂棉或几层滤纸更好。以便固定液能从上下左右前后渗入组织块。软组织或较大块组织可以经2-3小时固定后，再修整成小块重新投入新配制的固定液内继续固定。

2固定时间

应根据组织的种类、性质、大小，……渗透力的强弱而定。

如：一般组织，以10%福尔马林固定24h……

适当地增加温度可缩短固定时间。

· 常用固定液：

固定液特点：

①有较强的渗透力，能迅速的渗入组织内部；

②不使组织过度收缩或膨胀，并能使组织内待观察的成分凝固因为不溶性物质；

③能使组织达到一定的硬度并获得较佳的折光率和对某种染料具有较强的亲和力。

（1）单纯固定液

甲醛    10ml

蒸馏水  90ml

优点：渗透能力强，固定均匀，组织收缩小。

缺点：但经乙醇脱水后收缩较大。

· 酒精脱水注意事项：

1一般从70%酒精开始，由低浓度到高浓度逐步处理，如果固定液为酒精溶液，那就从与固定液中相同浓度的酒精开始脱水。

2对一些柔软组织，如胚胎组织，应从70%酒精以下50%或30%开始脱水。

3脱水的时间根据组织的种类、体积大小和厚度而定，一般与组织的大小成正比。

脱水必须在有盖瓶子内进行，特别是高浓度酒精。

脱水兼透明脱水剂：脱水后直接可以浸蜡

10玻片的清洗

新的载、盖玻片：必须经清洁液处理后方能使用，方法是先用自来水冲洗或洗衣粉擦拭冲洗后，再入清洁液浸泡一天以上，取出经清水冲洗，转入95%酒精内浸泡脱脂后，用干净的棉布及绸布擦干备用，一般玻璃仪器可放入干燥箱内烤干备用。

经染色并封片后的载玻片：可先在酒精灯上加温以除去或放入大量废二甲苯浸泡一周左右，盖玻片即能与载玻片自然分离，然后投入碱皂水中煮沸，用自来水冲洗后，按新玻片处理法处理。

浸蜡步骤：

1:1二甲苯和石蜡(30-45min)→石蜡(30-45min)→石蜡(30min)

包埋步骤：

    将熔化好的石蜡倒入包埋组或包埋盒，用加温的镊子将组织块切面朝下放入，做好标记，冷却，完全凝固后，修整蜡块。

包埋温度：与浸蜡温度接近或高2℃左右。