文献
2019
Genome Biology
Cold stress induces enhanced chromatin accessibility and bivalent histone modifications H3K4me3 and H3K27me3 of active genes in potato
研究背景
真核生物的染色质开放区域富含顺式作用元件（CRE），这些开放的染色质对各种核酸酶（包括DNaseI和Tn5）的切割表现出明显的敏感性，而与核小体紧密结合的染色质对这些核酸酶的敏感性大大降低。这些基因组区域被称为DNaseI敏感位点(DHSs)，可以通过DNase-seq或ATAC-seq进行鉴定。DHS中明显富含CRE，包括启动子和增强子。
组蛋白修饰在基因响应环境和发育信号的表观遗传调控中起着重要作用。同一核小体上同时含有激活型和抑制型组蛋白修饰被称为二价结构域。H3K4me3和H3K27me3标记的二价结构域首次在小鼠胚胎干细胞（ESCs）中被发现。在哺乳动物中，H3K4me3-H3K27me3二价结构域主要与ESCs中谱系特异性基因的启动子重叠，这些基因的表达水平较低，以维持ESCs的多能性。二价结构域中的H3K4me3标记被认为是平衡基因的激活，而H3K27me3则保持它们的抑制。
马铃薯是最重要的非谷物粮食作物。马铃薯块茎必须储存在低温下，以防止发芽，减少损失。但是冷藏会引发还原糖的积累，这被称为冷致甜味(CIS)，CIS是马铃薯产业面临的最紧迫最持久的挑战。了解马铃薯在冷藏过程中的基因表达和调控十分重要！
结论1 DHSs的鉴定及注释
Fig S3
对三种材料进行Dnase-seq测序，分别为室温下储存的块茎（称为RT），4℃下储存的块茎（cold tubers）和叶片（leaves），每种材料两个生物学重复。测序数据比对到参考基因组DM v4.04，使用Popera软件鉴定DHSs.只有在两个生物重复中独立鉴定的一致DHSs才保留用于下游分析。DHSs的密度与基因密度正相关，与转座子密度负相关（Fig S3）。
Fig 1
通过Fig 1的注释可以看到，来自RT的大约20.4%的DHSs被定位在转录起始位点上游1kb内。大部分DHSs (42.5%)位于基因间区（定义为距离任何TSS或转录终止位点至少1kb）。叶片和RT的DHSs分布类似，冷块茎和RT以及叶片的DHSs分布存在明显不同。
结论2 基因区DHSs与基因表达的关系
Fig S4
超过一半的低温块茎DHSs是低温条件下特有的，并且38.5%的低温块茎DHSs位于基因的外显子和内含子上（Fig S4）。相比之下，42.4%的DHSs是RT特有的，但只有14.5%位于基因的内含子和外显子。
Fig 2
在7314个外显子或内含子中含有冷块茎特异性DHSs的基因中，超过69%的基因在冷块茎中存在差异表达和普遍上调，在RT中发现了类似的规律。
作者发现，与RT相比，冷处理块茎中共有7096个基因上调，6622个基因下调。与下调基因相比，上调基因更频繁地与位于外显子和内含子上的温度特异性DHSs相关（z检验，p<0.0002，Fig 2a）
相比之下，上调和下调基因与位于启动子（TSS上游1kb）和基因间区域的温度特异性DHSs的关联频率相似（Fig 2a），这些结果表明，温度诱导的DHSs在基因区域的变化通常与基因表达的变化有关。
定义：RT与叶片之间的差异表达基因为组织特异性基因，RT与冷处理块茎之间的差异表达基因为温度特异性基因。
通过Fig 2b可以看出位于基因区域的DHSs与温度特异性的DEG更相关，而位于非基因区域的DHSs与组织特异性DEG更相关。
进一步，作者选取的一组与碳水化合物合成相关的基因，这些基因在RT和冷处理块茎中存在差异表达，并且碳水化合物代谢途径是冷胁迫下反应之一。因此，这些与碳水化合物相关的基因可以代表那些对冷应激作出反应的基因。同样，作者从光合途径中选择了52个DEG来代表组织特异性基因。然后，我们将光合作用基因中的DHS模式与碳水化合物相关基因中的DHS模式进行了比较（Fig 3c）。结果表明，17%和6%的光合基因外显子和内含子中分别含有组织特异性DHSs。相比之下，37%和36%的碳水化合物相关基因在外显子和内含子中分别含有温度特异性DHSs，显著高于光合基因（z检验，p<0.0002）。此外，与碳水化合物相关基因相比，位于TSS和TTS上下游1kb的组织特异性DHSs与光合基因的关联比例更高（z检验，p<0.0002)。
结论3 冷处理特异性DHS的基序分析
Fig 3
作者检测了位于启动子区域的前1000个冷特异性DHSs（根据读取密度排序选择）中富集的DNA基序，并将其与已发表的转录因子结合基序进行了比较。Dof 转录因子家族靶向基序在14.4%的DHSs中富集程度最高（e value=3.0e−76），Dof家族已经被证实在多种胁迫（如冷、热、干旱）的响应中发挥重要作用。
GATA家族的结合motif在外显子区域的冷处理特异性DHSs中显著富集。植物种特有的GATA转录因子，如ZML1和ZML2，可以响应多种环境胁迫，如冷、冻、伤口等。因此马铃薯种GATA的同源基因可能对冷胁迫起调控作用。
在内含子的冷处理特异性DHSs种显著富集到一个单核苷酸G的motif，该motif与MYB55的结合基序类似。
结论4 Dnase I 敏感性的升高与冷处理块茎种基因表达的关系
Fig S6
在三种材料中将基因按照表达量分成四份，发现高表达的基因具有更高的Dnase I敏感性，并且在TSS上游200bp的区域敏感性最高（Fig S6）。
Fig 4
作者比较了RT和冷处理块茎中所有基因DNase I 敏感性水平。发现无论是表达的基因还是始终沉默的基因，都表现出在冷处理后TSS上游1k以及TTS下游1k 敏感性的降低以及基因体上敏感性的上升（Fig 4a）。
用类似的方法比较的叶片和RT，发现不表达的基因Dnase I敏感性基本不变，表达的基因在TSS上游和TTS下游在叶片中敏感性更高。
结论5 低温块茎中H3K27me3在活性基因的基因体区域累积
Fig 5
染色质修饰，包括组蛋白修饰，在植物对环境胁迫的反应中起着不可或缺的作用。作者想进一步研究在冷处理块茎中观察到的不同DHS模式（Fig 4a）是否与任何特定的组蛋白修饰有关。有趣的是，冷块茎中表达基因的基因体区域（FPKM >1）富集了H3K27me3（Fig 5）。低温块茎中高表达的基因与5‘和3’端相对较低水平的H3K27me3相关，这种独特的H3K27me3富集在RT或叶片中的活性基因中没有观察到。
Fig 6
在RT中组成型沉默的基因明显与H3K27me3相关（Fig 6a），与活性基因相关的H3K27me3的平均水平与基因间序列相似。相比之下，冷处理块茎活性基因上的H3K27me3表达水平显著高于组成型沉默基因（Fig 6b）。对比RT和冷块茎的H3K27me3信号发现，只有活性基因在冷块茎中显著富集H3K27me3 （Fig 6c），而这些基因的核小体密度在RT和冷块茎中保持相似，这表明冷块茎中H3K27me3的富集而不是核小体的富集。
Fig S8
Fig S9
此外，无论差异表达方向如何，所有在冷胁迫下表达的基因都表现出类似的H3K27me3富集增加（Fig S8），对基因体区域H3K27me3信号强度的定量分析显示，在冷胁迫下，92%活性基因的H3K27me3水平升高（Fig S9），而大多数组成性沉默基因和基因间区域显示H3K27me3水平降低。这些结果共同表明，在冷胁迫下，H3K27me3优先沉积到活性基因的基因体区域。
结论6 冷处理块茎中活性基因的H3K4me3模式
在RT中，H3K4me3仅与活性转录基因相关（Fig 6d），与在模式动物和植物物种中的观察结果一致。
在冷块茎中，H3K4me3更广泛地分布在所有活性基因的基因体区域中心（Fig 5，Fig 6e），有趣的是，在冷块茎中观察到H3K4me3在组成性沉默基因中的沉积（Fig 6e）。
结论7 冷处理块茎中二价性标记与活跃基因
Fig S11
H3K4me3和H3K27me3在同一核小体上共存，被称为二价组蛋白标记。众所周知，二价性组蛋白标记与哺乳动物干细胞分化和发育的平衡基因的启动子有关。
两种组蛋白修饰信号都在核小体上表现出震荡，并且K4和K27的震荡峰几乎重叠，表明K4和K27可能在冷胁迫后沉积在相同的核小体上。为了检验K4和K27的二价标记是否真的沉积在同一个核小体上，作者进行了Sequential ChIP，先使用K4的抗体，再使用K27的抗体，通过两个不同抗体和两次 ChIP 反应，得到K4和K27同时存在的DNA片段。对照是在第二次ChIP中不加K27抗体。另外，还反着做了一次，即先加K27抗体，再加K4抗体，对照是只加K27抗体。
Fig 7
33%的活跃基因（6442/19482）在冷胁迫后在同一核小体上表现出二价性标记的富集（Fig 7）
Fig S13
二价H3K4me3-H3K27me3结构域在人类CD4 +记忆T细胞中被发现与组蛋白修饰H3K4me1相关。因此，作者也进行了H3K4me1 ChIP-seq来检测该标记与冷块茎中二价标记相关基因的潜在关联。有趣的是，冷胁迫下H3K4me1只在二价标记相关基因中富集（Fig S13a），而其余活性基因与H3K4me1水平降低相关（Fig S13b）。因此，冷块茎中的二价H3K4me3-H3K27me3标记与先前在人类CD4 +记忆t细胞中观察到的H3K4me1的关联模式相似。
结论8 二价基因的表达特性
Fig S14
之前的研究发现，在哺乳动物中K4和K27的二价性修饰会抑制基因表达，但是作者在这里发现冷处理块茎的二价性修饰导致47.5%的基因上调，31%的基因下调，21.5%的基因没有显著变化。虽然这三组基因的表达水平存在显著变化，但是二价修饰的信号没有显著差异（Fig S14），这说明二价组蛋白修饰水平倾向独立于基因表达水平的变化。
Fig 8
通过GO富集，作者发现冷处理块茎中的二价性基因，特比是表达上调的二价性基因主要与应激反应和代谢相关（Fig 8）。下调的基因与发育和生殖过程相关，这与K4-K27二价性标记抑制胚胎干细胞和精子的发育相关基因但使其快速激活一致。
结论9 二价基因的染色质可及性
Fig S15a-c
为了进一步研究二价性基因是否更容易接近，作者比较了二价性基因和其他活性基因在基因区域的DNase I敏感性水平（即染色质开放程度）。对于在冷处理块茎中上调和不变的二价性基因，整体看来有更高的染色质可及性，而下调的二价性基因染色质可及性相似（Fig S15a-c）。
Fig S15d-f
此外，作者比较了低温块茎和RT中基因的染色质可及性，发现低温胁迫下二价标记相关基因DNase I敏感性的显著升高，包括上调、下调和组成型表达基因（Fig S15d-f）。这些结果表明，二价标记相关基因的染色质在冷胁迫下变得更容易接近。
Fig S15g-i
有趣的是，在冷胁迫下与其他下调和组成表达的基因相比，二价基因下调和组成表达的基因在表达上的变化更小（Fig S15g-i），这表明二价标记相关基因中DNase I敏感性的更高升高似乎与转录的更大变化无关。
以上结果暗示二价组蛋白修饰可能通过提高染色质可及性，作为对冷胁迫的反应。
总结
（1）冷胁迫下产生了大量的可及性区域，这些可及性区域富集在冷胁迫诱导的差异表达基因附近。
（2）活跃基因在冷胁迫下表现出染色质可及性增强。
（3）冷处理块茎中大量的活跃基因与gene body区域的二价性组蛋白修饰相关。
（4）与二价修饰相关的冷处理后上调的基因与参与应激反映，下调的基因参与发育过程。
（5）与二价修饰相关的基因在冷胁迫下染色质可及性更高。
