文献信息
标题：Extracellular Vesicle Integrins Distinguish Unique Cancers
DOI(url): https://doi.org/10.3390/proteomes7020014
日期及杂志：11 April 2019, proteomes
作者及单位：Stephanie N, Department of Biomedical Sciences, Florida State University College of Medicine, Tallahassee
文献概述(这篇文献的结论是什么？)
细胞外囊泡(EVs)的蛋白质组学特征越来越引起人们的兴趣，特别是在了解癌症生长、耐药性和转移方面。最新数据表明，癌症衍生的EV携带一系列致癌物，包括某些整合素蛋白，这些整合素蛋白可能反过来促进细胞脱离、迁移和未来转移部位的选择。我们之前报道了60种不同人类癌细胞系分泌囊泡蛋白的大量比较。在这里，我们分析了这些癌症EV的不同整合素谱。我们进一步证明，与良性上皮细胞分泌的囊泡相比，肿瘤上皮细胞中整合素受体显著富集。在多种上皮癌细胞中，EV整合素的总水平，包括整合素α6、αv和β1的数量与肿瘤分期相关。特别是，整合素α6也在很大程度上反映了乳腺和卵巢祖细胞的表达，突出了这种整合素蛋白作为某些原发性肿瘤的潜在循环生物标志物的效用。本研究为囊泡相关整合素蛋白在检测癌细胞存在和预测肿瘤分期方面的价值提供了初步证据。整合素在癌细胞中的差异表达以及整合素在ev中的选择性包装可能有助于进一步了解各种癌症类型的肿瘤生长和转移的发生和进展。
文献结果(每个结果的图片详细解读)
1、通过NCI-60 panel绘制的细胞外囊泡整合素谱
图1A. NCI-60细胞系分泌EV的α和β整合素亚基表达谱，其中横坐标为60个细胞系中9个特定的组织学起源，由图1A可知，整合素β1在所有细胞分泌的EV中普遍以不同的水平存在，而其他整合素则更有选择性地表达。α2、α3、α6、αv、β1和β4亚基组成了癌症EV中分泌的绝大多数整合素（图1B）。整合素α3通常与β1亚基以1：1的比例分泌（图1C），这种正相关和比值高度表明，癌症EV中分泌了大量的整合素α3、β1。
2、所选择的EV整合素蛋白反映了祖细胞的表达
图2分别显示乳腺、肾脏、结肠、卵巢癌中整合素亚基的表达数与之前报道的全细胞表达数的相关性，说明部分EV整合素蛋白反映了其祖细胞的表达。其中，图2A的整合素αv与全细胞表达数成显著负相关，可能揭示了EV蛋白的选择性打包。
3、与良性ev相比，癌细胞衍生的ev中整合素的表达差异
从乳腺良性上皮细胞系MCF10a中获取细胞外囊泡，并进行类似的纯化以进行质谱分析（图3A）。将所有六种乳腺癌源性EV共有的蛋白质与MCF10a EV中发现的蛋白质进行比较(图3B)，在乳腺癌和良性EV蛋白之间发现了显著的重叠。在无偏富集分析中，乳腺癌EV中富集的蛋白质参与了整合素表面相互作用、β1整合素相互作用和syndecan介导的信号传导等生物学过程(图3C)。在乳腺细胞来源的ev中，整合素亚基的归一化光谱计数比较表明，肿瘤EV中存在显著的过表达整合素(图3D)，在乳腺良性EVs中仅检测到整合素α1、α6、αv和β1。在乳腺癌EV中发现的常见α和β整合素亚基的分解与癌症EV整合素的一般特征非常相似(图1B和图3E)。虽然整合素β1仍然是良性乳腺上皮细胞中主要的β亚基，但整合素α1构成了大多数α亚基(图3F)。
4、EV整合素水平预测癌症分期
在细胞源性EV中发现的所有整合素蛋白的总光谱计数随着肿瘤进展增加(图4)。特别是整合素α6、αv和β1。
文献方法(使用的生物信息学方法)
1、数据来源
NCI-60细胞系分泌的EV蛋白数据：来源于之前的研究（相关文献1）
MCF10a细胞系分泌的良性EV蛋白数据
2、EV富集和蛋白质定量
通过纳米颗粒跟踪、免疫印迹分析和电子显微镜证明了样品的富集效果和纯度，并使用基于荧光的EZQ™试剂盒(ThermoFisher, Waltham, MA, USA, R33200)进行EV蛋白定量。
3、质谱分析
进行液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)分析
4、归一化
使用MS-Amanda Proteome Discoverer、Mascot和Sequest搜库。将MCF10a EV数据在重复中取平均值，然后将整合素光谱计数乘以计算的归一化因子(所有良性和癌性乳腺癌EV的每个样本的平均总光谱计数除以每个样本中确定的总光谱计数)，归一化到先前分析的NCI-60 EV蛋白。
5、蛋白质富集分析
使用FunRich v3比较了MCF10a EV中鉴定的蛋白质与所有六种乳腺癌EV样本中鉴定的蛋白质之间生物过程的差异富集。所有矫正后p值小于0.5的项都被认为是显著的。
6、统计分析
NCI-60 EV整合素蛋白的差异表达之前通过DESeq2进行了分析。本研究采用简单的线性回归分析来检验细胞和EV整合素水平之间的相关性。同样，通过线性回归分析，分析了EV分泌的α和β亚基水平之间的关系。通过单因素方差分析(ANOVA)和事后两两比较来评估不同肿瘤分期整合素水平的统计学意义，置信区间为95%。使用Microsoft Excel和CorelDraw X5软件进行制图。
文章亮点(这篇文献的优点在哪？)
文章通过与全细胞蛋白表达的相关性分析，将EV蛋白与其祖细胞联系起来，同时，整合素αv表现出负相关，表明EV蛋白可能存在选择性打包。
与肿瘤分期的相关性研究表明，EV蛋白有作为癌症生物标志物的潜力。
我的疑问(这篇文献的不足在哪？)
可以考虑使用原发肿瘤样本替代细胞系，增强研究结果的普遍性。
本文提到EV整合素在引导基于EV细胞趋向性的器官特异性转移中的作用，可以进行进一步的研究。
和我相关(我从这篇文献里学到了什么？)
- 对于多个癌症分期判断是否有显著差异，可以使用ANOVA+事后两两比较的方式。
