环状RNA的识别包含了序列比对和环状RNA预测两步，该软件目前更新到了v2版本，相比v1版本，用法有较大变化。在v1版本中只支持tophat-fusion和STAR两款软件进行序列比对来识别junction reads,在v2版本中，扩展到了以下5种软件
- TopHat2/TopHat-Fusion
- STAR
- BWA
- MapSplice
- segemehl
原理
image.png
- Align用于将序列比对到参考基因组上;
- Parse用于从比对结果中挑选junction reads;
- Annotate用于预测环状RNA;
- Assemble用于组装环状RNA的转录本序列；
- Denovo根据序列组装结果，识别新的环状RNA和分析环状RNA上的可变剪切事件
安装
- pip install circexplorer2
- conda install circexplorer2 --channel bioconda
该软件分为以下5个功能模块：
- Align：用于将序列比对到参考基因组上
- Parse：用于从比对结果中挑选junction reads
- Annotate：用于预测环状RNA
- Assemble：用于组装环状RNA的转录本序列
- Denovo：根据序列组装结果，识别新的环状RNA和分析环状RNA上的可变剪切事件
使用方法
1. Align
虽然支持多款序列比对软件，但是由于tophat的结果更方便后续的cufflinks软件进行分析，官方推荐使用tophat来进行比对。针对单端序列的比对，代码如下
CIRCexplorer2 align \
-G hg19.gtf \
-i bowtie1_index \
-j bowtie2_index \
-f RNA_seq.fastq \
> CIRCexplorer2_align.log
值得注意的是，align模块仅提供了针对单端序列使用tophat进行比对的功能，如果你是双端测序的结果或者想要使用其他软件，只能是自己手工进行比对，这里比较推荐STAR软件，速度较快，缺点就是内存消耗较大。
2. parse
parse用于解析序列比对的结果，支持多款软件，以常用的STAR为例，代码如下
CIRCexplorer2 parse \
-t STAR \
Chimeric.out.junction \
> CIRCexplorer2_parse.log
对于其他软件的用法，具体请参考官方文档，无论是什么比对软件，该命令最终都会生成以下文件
back_spliced_junction.bed
3. annotation
这一步就是根据已知的线性转录本信息，识别环状RNA，所以需要提供参考基因组对应的注释文件，官方也提供了脚本来帮助我们下载，用法如下
fetch_ucsc.py hg19 ref hg19_ref.txt
预测环状RNA的代码如下
CIRCexplorer2 annotate \
-r hg19_ref.txt \
-g hg19.fa \
-b back_spliced_junction.bed \
-o circularRNA_known.txt \
> CIRCexplorer2_annotate.log
-o参数为输出结果，内容示意如下
image.png
每列的含义如下所示
image.png
如果你只是想要使用这个软件来预测环状RNA,那么多款序列比对软件都可以选择，但是你想要使用完整功能，则必须使用tophat来进行比对。
参考资料：
