高通量测序技术的应用-DNA-seq&RNA-seq_图文_百度文库
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【内容节选自（采用16S rDNA高通量测序技术分析油藏微生物多样性）仅仅作为参考交流，侵删】
*为方便后续交流，以文献中的实例作为参考。
1、微生物样本
样本采集自吉林油田FY区，在同一区域的3口采油井取井口产出液，每口采油井取1个油水混合样本，分别编号为D1、D2、D3，取样采用无菌容器。
2、样本总DNA提取
取水样300-400ml，使用0.22um滤膜抽滤，抽滤后的滤膜剪碎，用于总DNA的提取，采用FastDNATM SPIN kit for Soil试剂盒（MP公司）【土壤基因组DNA提取试剂盒】提取总DNA，提取的总DNA经1%琼脂糖凝胶电泳检测完整性，超微量分光光度计（Thermo NanoDrop2000）检测浓度，检测合格后保存于-20℃，用于后续实验。
3、16S rDNA序列扩增
为避免序列太长影响测序，同时兼顾扩增特异性，选用通用引物515F/907R对总DNA样品进行细菌16S rDNA序列片段扩增，引物序列为：
515F：5'-GTGCCAGCMGCCGCGG-3'
907R：5'-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3'
PCR反应采用TransStart Fastpfu DNA Polymerase，20ul反应体系，DNA模板10ng，为保证测序数据的准确性和可靠性，使用尽可能低的循环数扩增，并保证每个样本扩增的循环数一致，经预实验，选定为27个循环，反应参数为：
95℃，3min；
95℃，30s；
55℃，30s；
72℃，45s；
72℃，10min；
27个循环，每个样本做3个重复，重复样本PCR产物合并后经过1%琼脂糖凝胶电泳检测，浓度和特异性合格后用于后续高通量测序。
4、16S rDNA PCR产物高通量测序
测序由上海美吉生物医药科技有限公司完成，采用第二代DNA高通量测序技术。PCR产物经过2%琼脂糖凝胶电泳，使用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒（AXYGEN公司）切胶纯化，Tris-HCl洗脱，经2%琼脂糖电泳初步检测浓度。参照电泳初步定量结果，将PCR产物用QuantiFluor TM-ST蓝色荧光定量系统（Promega公司）进行检测定量，根据定量结果和测序量要求，取PCR产物构建测序文库，建库主要步骤为：
（1）、连接“Y”字形接头；
（2）、使用磁珠筛选去除接头自连片段；
（3）、利用PCR扩增进行文库模板的富集；
（4）氢氧化钠变性，产生单链DNA片段，不同样本合并测序，以接头中包含的不同索引序列（Index sequence）加以区分，使用Illumina Miseq PE300测序平台，此测序平台采用桥（Bridge）式扩增产生DNA簇和边合成边测序的原理，双端测序，读长2X300bp。
5、测序原始数据处理
Miseq测序得到的双端序列数据，以fastq格式存储，分为fq1和fq2两个文件，根据文件中存储的每条read的质量值信息，去除测序质量较低的碱基。方法是在每条read尾部设置50bp的窗口，若平均质量分数低于20，截去末端碱基。根据序列配对关系进行拼接，最小重叠长度为10bp，最大错配率为0.2，拼接后得到优化序列，根据引物和索引序列区分不同样本。为了便于分析，将相似的优化序列进行聚类，相似性高于97%的序列归为一个单元分类，即一个OTU（Operational Taxonomic Units），在聚类过程中去除嵌合体，采用RDP classifier贝叶斯算法对97%相似水平的OTU代表序列进行分类学分析，选用Silva核糖体数据库，分析过程中使用Trimmomatic、FLASH、Usearch和RDP Classifier等软件平台。
6、多样性分析
使用mothur软件进行多样性分析，评估测序深度的指数采用Good's Coverage（C），C=1-n1/N，其中n1为只含有一条序列的OTU数目，N为序列总数。计算菌群多样性的指数采用Shannon-Wiener（H'）和Simpson（D）,H'=ΣPi In pi，其中pi=ni/N，D=Σni（ni-1）/[N（N-1）]，本研究中用于指数评估的OTU相似水平为97%（0.97），同时使用Mothur软件绘制稀释性曲线和Shannon-Wiener曲线。
