1. Author
Daniel Christ教授是澳大利亚悉尼Garvan医学研究所抗体治疗学负责人。他曾在瑞士剑桥大学完成博士阶段的学习。期间，他与诺贝尔奖获得者Gregory Winter一起在MRC分子生物学实验室工作。Daniel于2007年加入Garvan，担任抗体治疗主管，将结构和基因组方面的进展转化为癌症和炎症疾病的候选药物和治疗方法。他尤其以使用体外和体内选择策略来产生具有优异生物物理靶向特性的抗体而闻名。他的贡献得到了多个奖项和任命的认可，包括NHMRC卓越奖，以及近年来NHMRC和ARC颁发的15多项竞争性研究资助。Daniel将高通量选择和测序方法与生化和X射线晶体学分析相结合，研究和设计治疗性抗体与其靶标之间的相互作用。Daniel目前正在与新南威尔士大学Kirby研究所合作开发抗体，旨在靶向导致新冠肺炎的新型冠状病毒SARS-CoV-2的表面蛋白。这种抗病毒疗法可以为包括一线卫生工作者在内的高危人群提供“被动免疫”。
2. Background
冠状病毒SARS-CoV-2是全球covid-19大流行的病原体，已导致全球600多万人死亡。SARS-CoV-2感染后，人的适应性免疫反应产生抗体，对抗病毒刺突表面糖蛋白。大多数中和抗体结合刺突受体结合域(RBD)，特别是受体结合基序(RBM)中的1类和2类表位，直接阻断与人血管紧张素转换酶受体2 (ACE2) 3-6的相互作用。这种针对RBD和RBM的抗体也会在接种疫苗后产，但往往缺乏对新出现突变株的中和潜力。最近，广泛的中和抗体已经被发现结合在RBM区外。这些抗体通常结合在Sarbecovirus之间保守的区域(3、4和5类表位)，预计对VOCs具有更强的抗氧化能力。然而这种抗体在大多数接种疫苗的个人和恢复期患者中很罕见。除了疫苗接种，重组抗体的使用已被证明成功用于治疗和预防covid-19，一些单克隆抗体已获得监管部门的批准，并在免疫缺陷个体和16 - 18岁的老年人中显示出特别的前景。然而，突变株层出不穷，现有的临床抗体的中和能力逐步丧失，特别是RBM区域携带突变的变体(包括Beta和Omicron变体)。为了克服这种耐药性，研究集中在广泛中和抗体的开发。如Sotrovimab (S309)，它针对的是3类表位，这在sarcovirus中是保守的。此外，针对RBD表面多个非重叠表位的抗体鸡尾酒已经被开发出来以克服耐药性。
3. Methods
1. 抗原的表达纯化
2. B细胞的分选
3. 单克隆抗体的表达纯化
4. ELISA
5. 生物膜干涉实验BLI
6. 新冠病毒中和实验
7. X射线晶体衍射
8. 冷冻电镜
9. 动物实验
4. Results
实验团队从之前的研究样本中，利用流式细胞分选得到CD3-CD19+CD20+CD10-IgD-IgG+ 的B细胞。同时结合三种突变体（Mut1：T500A N501A Y505A——扰动ACE的结合抗体、Mut2：L455A F456A——阻止与ACE2结合抗体、Mut3：K378——阻止与CR3022结合表位相同的抗体）进行筛选。利用上述“表位原则”的筛选，实验团队筛选得到了一系列的抗体，例如①1/2类抗体，竞争性结合ACE2——GAR04/05/06/07/09/15/20；②4类抗体，与sarbecovirus（SARS-CoV-1, pangolin CoV 和bat RaTG12-CoV）具有很好的交叉反应性——GAR11/13/14/16/20；③5类抗体，同样具有交叉反应行，但是结合的表位和CR3022不同——GAR01/03 ④ 值得一提的是，还筛选得到了一类新的表位的抗体，将其归为6类抗体。
GAR05是1类抗体的代表，他的Fab段可以和spike三聚体的每一个单体的up构象相结合。轻链CDR的 L1和L3与RBD接触进而形成一个附加的裂口，以适应Y505的侧链。同时GAR05的结合位点与Omicron不同谱系中的多个突变重叠。在Omicron VOCs的突变位点中，有8个与GAR05相结合。其中四个(S477N, T478K, E484A和F486V)形成环状结构。GAR05和RBD之间有十个氢键，其中两个涉及到以Y505为中心的轻链表位，这两个表位可能会被Omicron突变体Y505H和N501Y丢失。其余8个是重链中心的，其中7个与保守的RBD靶点接触，只有一个表位会被E484A突变体丢失。因此，GAR05对omicron VOCs保持紧密结合的能力。GAR05的结合模式与单抗P2C-1F11相似，与ACE2受体竞争性结合。另一种I类靶向抗体S2K14636也被描述为类似ACE2的抗体，因为它针对ACE2利用的多个进化保守残基，并对VOCs表现出广泛的抗性。S2K146的整体结合模式与GAR05相似。
除了传统的1-5类抗体以外，实验团队还筛选得到了6类抗体——GAR03/12。低温电子显微镜图显示：GAR03 Fab占据了NTD的空间与RBD结合。随后，实验团队将GAR03 Fab与RBD复合物结晶，并通过x射线晶体学求解其结构，证实了cryoEM提出的结合模式，即大部分接触界面是由抗体轻链介导的。结合表位与Omicron变异突变位置分离得很好。竞争结合实验表明，GAR03与5类抗体S2H97共同结合。然而，令人惊讶的是GAR03与SARS-CoV-2、SARSCoV-1、Pangolin CoV和Bat RaTG12-CoV RBD的交叉反应突出表明，该表位在sarcov病毒中高度保守。BLI竞争实验显示，另外两种有效的中和抗体，GAR12和GAR17，都与GAR03和S309(3类表位)竞争。为了验证这一假设，我们解决了与RBD配合物的GAR12 Fab的晶体结构。GAR12与RBD表面上的一个与S309重叠的表位结合，并与ACE2接触表面相连接。GAR12表位广泛地避免了VOC中的残基突变，导致了该抗体广泛而有效的中和作用。实验团队将这个由GAR03和GAR12共享的表位命名为6类。
后续的小鼠实验中，实验团队采用了鸡尾酒疗法，选取了1类抗体GAR05，6类抗体GAR12，4类抗体GAR20，发现无论从治疗还是预防两个角度进行观察，保护作用都是非显著，单独GAR05给药发现保护作用同样显著。这为疫苗的开发提供了很好的思路。同时为了评估GAR05和GAR12对Omicron BA.1及其亚变种的效力，实验团队使用活病毒进行了体外中和试验。观察到GAR05和GAR12对Omicron VOCs保持其活性，且大大超过了临床抗体Sotrovimab (S309)。
5. Discussion
作者：Romain Rouet
通讯作者：Daniel Christ
单位：Garvan Institute of Medical Research, Sydney, NSW, Australia
年份：2023.2.8
期刊：Nature Communication
科学问题：通过“表位筛选”原则得到的交叉中和抗体的特征是什么样子的
结论：通过基于 “表位筛选”原则得到的一系列的抗体，其中不乏有1/2类抗体，例如GAR05，无论是体内还是体外实验，这个抗体都可以很好的保护机体免受新冠的侵袭。与此同时，作者还找到并定义了一类新的表位——6类抗体。例如GAR03/17。这类抗体的结合表位位于3类和5类之间，相对保守。正是因为如此，他们对Sarbecovirus家族具有很好的交叉反应性。后续的小鼠保护实验也证明了：1类抗体GAR05，6类抗体GAR12，4类抗体GAR20联用可以很好的保护小鼠——这为疫苗的开发提供了新的思路。
