1. Author
Screaton教授于1984年获得剑桥大学的第一个学位，1987年搬到牛津完成医学研究。并于1998年获得了牛津大学的博士学位。2004年，Screaton教授被任命为帝国理工学院医学院院长。2017年10月，他回到牛津大学担任医学科学部部长。他的研究涵盖了RNA和细胞凋亡。目前的研究方向围绕着传染病免疫学包括登革热、出血热和寨卡病毒。
David Stuart的工作集中在病毒受体的相互作用和病毒组装的基本难题上，同时David Stuart正在进行许多病毒蛋白和酶的研究——它们是潜在的药物靶点和阐明病毒如何调节宿主反应。例如，天花病毒的免疫调节剂。
Juthathip主要研究是针对新出现病原体的免疫反应，特别是抗体反应，如登革热病毒、寨卡病毒、艾滋病毒、埃博拉病毒、SARS和MERS，以及最近的新型冠状病毒。Juthathip采用了包括病毒学、免疫学、生物化学和结构生物学在内的广泛方法来阐明致病机制，生产诊断和治疗试剂，设计疫苗，并为政策制定做出贡献。
2. Background
2.1 嵌合抗体（chimeric antibody）
随着分子生物学技术的迅猛发展，为克服鼠源性单抗的异源性反应，人工改造鼠源性单克隆抗体成为现实。1984年出现了嵌合重组抗体技术，1994年美国批准第一个嵌合抗体药物上市，至今嵌合抗体药物总数已有多个，包括Abciximab，Basiliximab，Pdtmximab，Cetuximab等。
人-鼠嵌合抗体：利用DNA重组技术将鼠源单抗的轻链、重链可变区插入含有人抗体恒定区的表达载体中，转化哺乳动物细胞进行表达所产生的单克隆抗体。人-鼠嵌合抗体的人源化程度可达到70%，完整的保留了鼠源单抗的可变区，最大限度的保留了亲本活性，人抗体恒定区的引入则大大降低了免疫原性。对于其他类型的人源化抗体，其优势在于，技术路线简单，易于操作;抗体完整性好，在体内滞留时间长;鼠源抗体的亲和力和特异性都得到保留，在临床上得到了良好的反应。
2.2 新冠变异株
新冠肺炎是SARS-CoV-2(新型冠状病毒)引起的一种急性病毒性疾病，新型冠状病毒主要影响呼吸系统，对世界人口产生了毁灭性影响，目前已导致全球380多万人死亡，并成为自1918年流感大流行以来最严重的全球健康危机。自2020年3月11日被世界卫生组织宣布为全球大流行以来，已经出现了多种重点关注的变种，如Alpha (B.1.1.7)、Beta (B.1.351)、Gamma (P.1)、Delta (B.1.617.2)、Omicron（BA.4/5），该病毒继续造成破坏，许多国家经历了这种病毒性肺炎的第二波或第三波爆发。SARS-CoV-2的基因组RNA全长29903nt，其中开发阅读框ORF1a和ORF1b被翻译，除基因组RNA外，还有9种主要的亚基因组RNA。新型冠状病毒与SARS-CoV和MERS-CoV相似，由四种主要结构蛋白组成:刺突蛋白(S)、包膜糖蛋白(E)、核衣壳(N)、膜(M)蛋白，以及16种非结构蛋白和5-8种辅助蛋白。截至2021年6月22日，自大流行开始以来，随着多种变种的出现，美国疾病控制和预防中心和世界卫生组织已经独立地建立了一个分类系统，将新型冠状病毒出现的变异区分为重点关注对象variants of concern (VOCs)、待观察对象variants of interest (VOIs)和正在检测对象variants under Monitoring(VUMs)。已发现五种重点关注对象，包括Alpha (B.1.1.7)、Beta (B.1.351)、Gamma (P.1)、Delta (B.1.617.2) 、Omicron（BA.4/5）。
Alpha
(B.1.1.7谱系):Alpha变种也称为GRY(formerly GR/501Y.V1)，2020年12月份首次在英国通过对新冠病毒全基因组测序而报道的，其特征是包括病毒基因组中的17个突变。其中，8个突变(δ69-70缺失、δ144缺失、N501Y、A570D、P681H、T716I、S982A、D1118H)在刺突蛋白(S)中。N501Y显示刺突蛋白对ACE 2受体的亲和力增加，增强了病毒附着和随后进入宿主细胞。据报道，它的传播性增加了43%至82%，超过了先前存在的新型冠状病毒变种，成为英国的主要新型冠状病毒变种，感染B.1.1.7谱系变体的患者与先前病毒株患者的死亡风险比为1.64。
Beta
(B.1.351谱系):Beta变种也称为GH501Y.V2，多重突变导致了2020年10月南非纳尔逊·曼德拉湾的第二波新冠肺炎感染。B.1.351变种包括刺突蛋白中的九个突变(L18F、D80A、D215G、R246I、K417N、E484K、N501Y、D614G和A701V)，其中三个突变(K417N、E484K和N501Y)位于RBD，增加了ACE2结合亲和力。据报道，这种变种通过单克隆抗体治疗、恢复期血清和疫苗接种后血清传播的风险增加，中和作用降低。
Gamma(P.1谱系):Gamma变种也被称为GR/501Y.V3，2020年12月在巴西发现，B.1.1.28变种在刺突蛋白中含有10个突变(L18F、T20N、P26S、D138Y、R190S、H655Y、T1027I、V1176、K417T、E484K和N501Y)。三个突变(L18F、K417N、E484K)位于RBD，类似于B.1.351变体。这种变体也可能降低了单克隆抗体疗法、恢复期血清和疫苗接种后血清的中和作用。
Delta
(B.1.617.2 谱系):Delta最初于2020年12月在印度发现，是2021年4月印度致命的第二波新冠肺炎感染的主要病毒变种。Delta变种最初被认为是一个待观察的对象。然而，这种变种在世界范围内迅速传播，促使世卫组织在2021年5月将其归类为重点关注的对象，B.1.617.2变异体在刺突蛋白中含有十个突变(T19R，(G142D*)、156del、157del、R158G、L452R、T478K、D614G、P681R、D950N)。
Omicron（BA.4/5谱系）: BA.5最初出现在南非，此后不久在葡萄牙出现，但已在世界各地检测到。它导致葡萄牙的住院人数显着增加，并迅速占据主导地位，现在在许多欧洲国家和以色列产生了不同程度的影响，BA.4/5变异体在刺突蛋白中含有4个独有的位点（Δ69-70，L452R，F486V，Q493）。
3. Methods
1. 蚀斑中和试验（FRNT）
2. ACE2和RBD蛋白的表达纯化
3. 生物层干涉测量（BLI）
4. 抗体的表达纯化
5. X射线晶体衍射
蚀斑中和试验（FRNT）
· 细胞接种：每孔按1 x 106细胞每毫升培养基接种细胞至6-孔板里。轻轻地前后左右摇晃培养板使细胞分布均匀。将细胞置培养箱生长过夜。第二天，显微镜下观察细胞确认细胞是否分布均匀并达到80%以上的融合度。
· 制备琼脂糖：用水配制2%的琼脂糖，高压灭菌并使之溶化，然后将琼脂糖置于42°C水浴中使之保持在熔解状态。将细胞培养基预热至37°C。（1h后确认琼脂糖温度是否处于42°C，观察其是否仍处于溶解状态但又不至于烫手）。
· 准备病毒梯度稀释液：标记6个无菌离心管，用于制备病毒稀释液。在第1管内加入990μl，剩下5管分别加入900μl细胞生长培养基。按以下方法进行梯度稀释：在第1管中加入10μl病毒原液（稀释度1:100）充分混匀，然后从第1管吸100μl加入第2管，依次类推，进行10倍梯度稀释。管2至管6的稀释度分别为 10-3 到 10-7。
· 感染细胞单层：用无菌吸管吸去6孔板中的培养液，每孔加入100 μl上述稀释好的10-3 到 10-7 的病毒液，留一个孔不加作为空白对照。每板按同样的方法操作。室温放置1h让病毒进入宿主细胞。
· 覆盖琼脂糖：1h后，小心吸去病毒液，避免碰到细胞。将2%的琼脂糖和预热的培养基按1:1的比例混匀后加轻轻地加1.5mL至每孔细胞上，室温静置20min使其冷却凝固成覆盖层。将培养板置室温或 27°C 培养 6-10 日。
· 空斑观察和计数：用光从45度角照射培养板，或者可以将培养板倒置在一个黑色背景上，计数空斑数量。为了更易于观察，也可以每孔加入1mL 0.03%的中性红（用水或PBS稀释），室温或27°C 孵育2-3h，未被病毒感染的细胞会被中性红染上而中间未被着色的小区域即为空斑（直径约为0.5-3mm）。计数每孔的空斑数量并按以下方法计算病毒滴度：病毒滴度（pfu/ml）=空斑数×(1 ml / 0.1 ml)/稀释倍数。
4. Results
P.1最早于2020年12月出现在巴西北部亚马逊省的玛瑙斯。随后迅速造成了全世界的大面积感染。P1相比于原始毒株，在个亚基上都有着突变：NTD—L18F, T20N, P26S, D138Y, R190S；RBD—K417T, E484K, N501Y；CTD—D614G,H655Y；S2—T1027I,V1176F。其中，因为K417T, E484K, N501Y的突变可以帮助新冠病毒逃逸大部分抗体，所以广受关注。在出现的诸多变异株中，他们在NTD的结构域中或多或少的存在着一些删除突变，比如：B1.1.7的Δ69–70和Δ144；B1.351的Δ242-244；P.1虽然没有删除突变，但是T20N,R190S是两个值得被关注的位点。
N501Y的突变可以是使RBD和ACE2的亲和力陡然上升7倍，当N501Y,K417,E484K同时发生时，亲和力会提升19倍。通过结构生物学的手段对二者的结合进一步说明，实验团队发现：①417位点位于RBD“颈”的背面，突变前的赖氨酸和ACE2的D30形成盐桥；②484位点位于RBD”左肩”上，由Glu变成了Lys可以促进静电互补作用进而增大亲和力；③501位点位于RBD“右肩”上，通过堆积力，增大了亲和力。
面对如此强大的变异株，许多抗体的中和能力都收到了影响，比如①RBD抗体：礼莱的两个抗体（LY-CoV16和LY-CoV555），再生元的REGN10933和阿斯利康的AZD8895或多或少对γ和β变异株失去了中和能力。但是AZD1061，AZDA744并没有丧失中和能力。其中IGHV3-53的抗体LY-CoV16的中和能力丧失可能是因为K417，N501Y位点的突变，LY-CoV555可能是因为E484K导致的。②NTD抗体：mAb159锐减了133倍。③IGHV3-53：150,158, 175, 222, 和 269。通过解析150 158 269的结构发现CDR-H3的 K417和CDR-L1的N501位点是抗体结合的重要位点，所以当这两个位点发生突变以后，亲和力会陡然下降。但在这些抗体中222几乎不受突变体的影响，仍然可以起到中和的作用。
进一步通过结构生物学的手段去理解“为什么222这个抗体并没有受到突变体的影响。”，一开始，417号位的Lys与抗体CDR99号位残基以微弱的盐桥键连接，而突变后仍然存在桥键作用。501号位突变增加了与抗体pro的堆叠作用。综上所述，222受突变体的影响最小。
正是因为mAb 222轻链可变区的特殊结构使得他能够对突变体仍有中和作用。所以作者想通过组装222的轻链可变区与其他3-53家族重链可变区，观察是否能够免疫变异株的逃逸。令人惊讶的是只要是222LC的嵌合抗体，都可以对突变株起到一定的中作用。
5. Discussion
实验团队从巴西一名感染患者的咽拭子中培养出的P.1（γ）分离株，并将其与其他三种病毒进行了比较:一种早期分离株B.1.1.7（α）和B.1.351（β）。后续测试了接种疫苗所诱导的免疫血清对P.1进行中和的能力，发现：免疫血清对P.1，B.1.1.7的中和能力下降，B.1.351下降最为严重。同时，实验团队还发现P.1 RBD对ACE2的亲和力增加，并通过晶体学研究了其结构基础。实验团队还通过结构生物学，研究了强效抗体mAb 222用来阻断RBD-ACE2相互作用。抗体mAb 222可以同时接触K417和N501的，从而对P.1/B1.351菌株产生抗性。在此基础上通过交换轻链来恢复某些抗体的中和作用。最后，实验团队收集了P.1（γ）、B.1.351（β）和B.1.1.7（α）的数据，并试图解释这些对早期SARS-CoV-2毒株产生的血清中和能力的不同影响。
