一、背景知识
CHIP-seq染色体免疫共沉淀技术。是研究==细胞内DNA与蛋白质互作==就是将chip实验得到的dna拿来测序，再进行下游分析。关键在于Chip实验。
ChIP被用来研究细胞内DNA与蛋白质相互作用，具体来说就是确定特定蛋白（如转录因子）是否结合特定基因组区域（如启动子或其它DNA结合位点）——可能定义顺反组。ChIP还被用来确定基因组上与组蛋白修饰相关的特定位点
用于在全基因组范围内研究DNA结合蛋白（相互反应）、组蛋白修饰（表观遗传标记）与 核小体 的技术。有助于了解基因之间的相互调控以及染色体的功能结构。
二、CHIP 实验
-
CHIP 实验流程分为：
- 蛋白交联到DNA上，保证蛋白和DNA能结合，找到互作位点。
- 超声波剪切DNA链
- 加上 带有抗体的磁珠用于 免疫沉淀靶蛋白。抗体很重要。
- 接触蛋白交联，纯化DNA
- 送测序，后续分析。
-
实验设计的关键：
- 抗体质量、
- 样本量（10-50ng DNA，PCR扩增越少，偏差越少）
- 空白对照：（排除假阳性的存在，开放染色体区域、重复序列） input DNA对照？？？、mock IP DNA（免疫共沉淀不含有抗体的DNA）、
三、CHIP 分析流程：
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CHIP-SEQ 分析流程，分析分为4步
- 质量控制，用的是Fastqc等
- 序列比对，Bowtie2或BWA
- peak calling， MACS
- peak注释， ChIPseeker
-
CHIP数据分析所特有的步骤：peak calling：
- 染色体上信号波形的定义；
- 建立背景矫正模型；
- 建立搜索peaks的准则，即建立判断怎样可以是一个peak（一般会用到背景矫正模型中的背景值）；
- 矫正模型，过滤掉假阳性的peaks；
- 给找到的peaks排序，给出显著度。
read只是跟随着TF一起沉淀下来的DNA fragment的末端，read的位置并不是真实的TF结合的位置。所以在peak-calling之前，延伸read是必须的。不同TF大小不一样，对read延伸的长度也理应不同。我们知道，测得的read最终其实会近似地平均分配到正负链上，这样，对于一个TF结合热点而言，read在附近正负链上会近似地形成“双峰”。MACS会以某个window size扫描基因组，统计每个window里面read的富集程度，然后抽取（比如1000个）合适的（read富集程度适中，过少，无法建立模型，过大，可能反映的只是某种偏好性）window作样本，建立“双峰模型”。最后，两个峰之间的距离就被认为是TF的长度D，每个read将延伸D/2的长度。
四、具体代码记录
目标：获取感兴趣的基因如ARF3在已发表的chip-seq数据AP3/PI/SEP3中是否存在相同的峰（位置，高度）
1. 文章数据下载
- SEP3: Target Genes of the MADS Transcription
Factor SEPALLATA3: Integration of
Developmental and Hormonal Pathways
in the Arabidopsis Flower GSE:GSE14600- AP3-PI:Molecular basis for the specification of floral organs by
APETALA3 and PISTILLATA GSE:GSE38358- AG : Control of Reproductive Floral Organ Identity Specification in
Arabidopsis by the C Function Regulator AGAMOUS GSE :GSE45938- AP1: Orchestration of Floral Initiation
by APETALA1- AP1/SEP3 GSE46986
- 根据 GSE号 以及 PRJNA 号下载
### 以AG数据为例
tail -n +2 AG-SraRunTable.txt |cut -f 7 |xargs -i nohup prefetch {} \&
- sra 数据转换fastq.gz，注意也可以不用--gzip参数
### 测序数据皆为单端测序，故不需要--split-3
for i in `ls *.sra`
do
nohup fastq-dump.2 --gzip -O 1_fastq/ $i &
done
2. 数据的质控
2.1 fastqc 处理
### 直接fastqc显示测序质量
ls *.fq.gz |parallel fastqc -o ./ --nogroup {} &
### MultiQC批量显示测序的质量
##在已经用fastqc得到测序的html文件和zip文件夹
multiqc *fastqc.zip --pdf
2.2 fastp处理
###fastp快速质控
fastp -i SRR502857.fastq.gz -o SRR502857_qc.fq.gz
### 出现adapter sequences的自动检测出现错误的问题，加上-A参数
###根据fastqc报告查看接头序列指定接头的序列
cat ~/miniconda3/envs/bioinfo/opt/fastqc-0.11.5/Configuration/adapter_list.txt
echo ">nextera" > nextera.fa
echo "CTGTCTCTTATACACATCTCCGAGCCCACGAGAC" >> nextera.fa
### 2018/7/10 -W sliding window -M 20
for i in `ls *.gz`; do i=${i%.fastq.gz};
fastp -3 -W 4 -M 20 -a AGATCGGAAGAG -i $i.fastq.gz -o ../clean_data/fastp_out_2.0/$i.qc.fq.gz & done
### 结果发现测序质量十分不错。
3. 序列的比对
### 构建索引 基本命令就是bowtie2-build 基因组序列.fa 索引名字
bowtie2-build Arabidopsis_thaliana.TAIR10.dna.toplevel.fa ath_index_bt1
### 比对
for i in `ls *.fq.gz`
do
i=${i%.fq.gz}
bowtie -p 10 --best --chunkmbs 320 Database/Ath/ath_index_bt1 -q $i.fq.gz -S $i.sam
done
### 2018/7/10 unique mapping对于bowtie1 需要参数-m 1
for i in `ls *.gz`;
do
i=${i%.qc.fq.gz};
nohup bowtie -p 5 -m 1 Database/plant/arabidopsis_th/ath_index_bt1 -q $i.qc.fq.gz -S ../3_mapping/unique_mapping/$i.sam >$i.log2 &
done
- samtools faidx Arabidopsis_thaliana.TAIR10.dna.toplevel.fa 1:14331064-14331662
4. Samtools转换
samtools view -bS SRR851694.sam | samtools sort -@ 4 - -T $i -o SRR851694.sorted.bam &
samtools index SRR851694.sorted.bam
5. BAM 转 bigwig文件 后续在IGV里查看各个基因的峰
bamCoverage -b AG_IP.sorted.bam --normalizeUsing RPKM --binSize 30 --smoothLength 300 -p 10 --extendReads 200 -o AG_IP.bw
6. call peaks 利用macs2软件，需conda下的pytho2.7环境。
### macs 较为严格的call peaks
macs -t SRR502859.sorted.bam -c SRR502860.sorted.bam -n AP3 -g 1.2e8 -p 1e-5 -O ../peaks_call/
### macs2 较为宽松的call peaks.
macs2 callpeak -t SRR016811.sorted.bam -c SRR016812.sorted.bam -B --nomodel -g dm --keep-dup 1 -n SEP3-rep2 --trackline --SPMR --call-summits
### macs2 2014年AP1/SEP3的Genome biology文章方法里所提供的macs2参数改进
macs2 callpeak -t ap1_rep1.sorted.bam -c control.sorted.bam -g dm --mfold 2 20 -q 0.001 -n ap1_rep1 --outdir macs2_new/ &
7. 不同peaks的交集并集处理
### bedtools处理
bedtools intersect -a ap1_peaks.narrowpeaks -b ag_peaks.narrowpeaks -wa |wc -l
### bedops 处理
bedops --intersect ap1_peaks ap3_peaks pi_peaks sep3_peaks > petal_peaks.bed
8. 注释Rstudio中用ChIPseeker
library(ChIPseeker)
library(clusterprofiler)
library(TxDb.Athaliana.BioMart.plantsmart28)
library(org.At.tair.db)
stamen_peak <- readPeakFile("stamen_intersect.bed")
## 注释
stamen_peak_anno <- annotatePeak(peak = stamen_peak,tssRegion = c(-3000,3000),TxDb = TxDb.Athaliana.BioMart.plantsmart28,level="gene")
stamen_gene <- as.data.frame(stamen_peak_anno)
###利用lappy集中注释
peak<- list(sepal_peak_RE,petal_peak_RE,stamen_peak_RE,carpel_peak_RE)
peak_anno <- lapply(peak,annotatePeak,tssRegion = c(-3000,3000),TxDb = TxDb.Athaliana.BioMart.plantsmart28,level = "gene")
sepal_peak_anno_RE <- as.data.frame(peak_anno[[1]])
plotDistToTSS(peak_anno)
###转id
keytypes(org.At.tair.db)
sepal_gene_test<- select(org.At.tair.db,keys = sepal_gene$geneId,columns = c("SYMBOL","GENENAME"),keytype = "TAIR")
### clusterprofiler功能注释
stamen_mf <- enrichGO(gene = stamen_specific$stamen_specific_PEvsST,OrgDb = org.At.tair.db,ont = "MF",keyType = "TAIR",pvalueCutoff = 0.05)
dotplot(stamen_cc)
其他
- 从染色体指定区段获取序列，并进行CArG-box的定位
samtools faidx /Database/plant/a_th/Arabidopsis_thaliana.TAIR10.dna.toplevel.fa 1:25686061-25687376|seqkit locate -i -d -p CHWWWWWWDG|tail -n +2|cut -f 1,5,6,7|perl -lne '@F=split/[\:\-\t]/;print $F[5],"\t" ,$F[1]+$F[3]'
- BAM 转 bigwig文件
bamCoverage -b AG_IP.sorted.bam --normalizeUsing RPKM --binSize 30 --smoothLength 300 -p 10 --extendReads 200 -o AG_IP.bw
