作者：Aron
审稿：童蒙
编辑：amethyst
引言
长读长测序技术的突破使得转录本结构鉴定、可变剪切等分析更为准确。上一期我们介绍了Iso-seq方法鉴定全长转录本：全长转录本鉴定。全长转录本鉴定之后，如何更精确地对全长转录本进行参考基因组比对分析，精确识别出基因异构体，是Iso-seq下游分析的关键。近几年，已经开发出多款用于三代长读长reads的比对软件，如GMAP、minimap2、deSALT等软件，可以较好地用于比对分析，下面我们具体看一下这些比对软件的使用。
1. GMAP
传统的使用比较多的长读长比对软件是GMAP，05年发表公布，最开始是用来比对低通量的est序列的，后来也有进一步升级为GSNAP支持高通量的二代测序。PacBio测序技术出现后，常用于Iso-seq转录本的鉴定，目前仍是相关研究引用量最高的比对软件，该软件也一直在持续更新升级。其可以将转录本序列与参考基因组序列比对，输出gff文件，比对速度稍慢，其使用方法如下：
## step1. 建立索引
~/software/gmap/gmap-2017-08-15/bin/gmap_build -D ~/Genome_DB -d hg38 hg38.genome.fa
## step2. 比对
## 如果参考基因组大于4G时，需要使用gmapl
~/software/gmap/gmap-2017-08-15/bin/gmap -D ~/Genome_DB/hg38 -d hg38 -f samse -n 0 -t 8 -B 5 sample.hq.fasta > sample.sam 2>log.txt
# -D 参考基因组建库路径
# -d 参考基因组名称，与建库名称对应
# -n 0 表示同时输出linear alignment和chimeric alignment(https://blog.csdn.net/tanzuozhev/article/details/80854579)
# -t,-B 分别为线程和batch数，内存足够大时可指定多个，加快运行速度
# -f 指定输出文件的格式
2. Minimap2
Minimap2是生信大牛李恒18年用C语言开发的可以用于三代数据（subreads、iso-seq）比对的长序列比对软件，与传统的三代比对工具GMAP相比，其速度有非常显著的提升，当然同时消耗的内存也比较大。使用方法也比较简单，近几年引用次数增长的也很迅速，所以大家可以试试用minimap2进行Iso-seq的比对。其使用方法如下：
minimap2 -t 30 -ax splice -uf --secondary=no -C5 -O6,24 -B4 hg38.fasta sample.hq.fasta > sample.sam 2>log.txt
# -t 线程数
# -ax 不同的数据类型指定不同的模式，如基因组的subreads，可以用map-pb\map-ont，Iso-seq的reads用splice,二代数据reads用sr等
# -uf 对于iso-seq数据，只考虑正义链转录本
# -C5 对于识别不同物种的剪切位点，灵敏度更高
# -O6,24 -B4 可以找到更多外显子
# 输出格式可支持sam和paf格式
3. deSALT
deSALT是19年底哈尔滨工业大学王亚东团队开发的一款专门针对于三代长reads测序的比对软件，主要可以处理四种数据类型：
- PacBio的CLR subreads（error rate:15%）
- CCS reads（error rate:1%）
- ONT的ONT 1D reads（error rate:25%）
- ONT 2D reads（error rate:12%）
该软件可以构造基于图的比对骨架以推断外显子，并使用它们来生成剪接的参考序列以产生精确的比对，更好的解决了小外显子和测序错误的问题。其使用方法如下：
deSALT index hg38.fa ~/Genome_DB/hg38.deSALT.index
deSALT aln ~/Genome_DB/hg38.deSALT.index sample.hq.fasta -t 30 -x ccs -O6,24 -M4 -o sample.sam
# -t 线程数
# -x 不同的数据类型指定不同的模式，ccs\clr\ont1d\ont2d
# -B 可以指定batch-size提升比对速度
# -O6,24 -M4 对于CCS序列，可以使用此参数，减少错配和gap，提升准确度
## 添加注释
python Annotation_Load.py hg38.gtf hg38.info #the annotation file should be in GTF format
deSALT aln -G hg38.info ~/Genome_DB/ sample.hq.fasta
4. STAR/BLAT
还有两款软件，STAR以及BLAT也可以用于长读长reads的比对，这两款软件比较早，相信大家也有所了解，虽然可用于长读长reads的比对，但这两款软件并不是专门为三代测序reads比对开发的，所以大家在做Iso-seq分析时，可以更多考虑使用上文介绍的三款。
5. 参考文献
Wu T D, Watanabe C K. GMAP: a genomic mapping and alignment program for mRNA and EST sequences[J]. Bioinformatics, 2005, 21(9): 1859-1875.
Li, H. (2018). Minimap2: pairwise alignment for nucleotide sequences. Bioinformatics. doi:10.1093/bioinformatics/bty191
https://github.com/lh3/minimap2
Liu, B., Liu, Y., Li, J. et al. deSALT: fast and accurate long transcriptomic read alignment with de Bruijn graph-based index. Genome Biol 20, 274 (2019). https://doi.org/10.1186/s13059-019-1895-9
