1. iTRAQ实验原理

iTRAQ（isobaric tags for relative and absolute quantitation，同位素标记相对与绝对定量技术）技术是由ABI公司开发的一种体外标记技术，采用4种或8种同位素的标签，可与氨基（包括氨基酸N端及赖氨酸侧链氨基）反应实现连接，再通过质谱分析可同时对最多8种不同样品中蛋白质进行定性和定量分析[Ross PL, Huang YN, Marchese JN, et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Mol Cell Proteomics, 2004, 3(12): 1154-69. Pierce A, Unwin RD, Evans CA，et al. Eight-channel iTRAQ enables comparison of the activity of six leukemogenic tyrosine kinases. Mol Cell Proteomics, 2008, 7(5): 853-63]。

iTRAQ试剂由三部分组成：报告基团、平衡基团和氨基反应基团。在一级质谱中，不同来源的相同肽段被连接上总质量相同的完整iTRAQ标签试剂，具有相同质荷比，表现为一个峰。在二级质谱中，iTRAQ标签试剂在不同基团连接处发生断裂，试剂中报告基团表现信号（平衡基团发生中性丢失），根据不同报告基团（四标为114,115,116和117Da，八标为113、114、115、116、117、118、119和121 Da）信号峰强弱进行肽段定量，并根据肽段二级质谱信息实现肽段定性，并最终回溯到蛋白水平。

iTRAQ技术的优势：

通量高：可一次实现最多8次样品的分离分析。

重复性好且定量准确：所有样品的分离鉴定条件完全一致，保证了实重复性，同时增强定量的准确性。

分辨率高：可与最高分辨率的LC-MSMS技术结合，实现对低丰度蛋白的定量定性。

数据丰富：可以获得检测到的所有蛋白的定性和定量信息。自动化程度高：以高分辨率液质联用为基础，自动化操作，分析速度快。

2. iTRAQ操作流程图

3. iTRAQ实验步骤

1）样品制备​

a. 植物组织样本

1.  将冷冻的样品取出，加入液氮，充分研磨。

2.  按照1：10的比例加入预冷的含10%TCA的丙酮，-20°C沉淀1小时。

3.  4°C，15000g离心15min，取沉淀，加入预冷丙酮，-20°C沉淀1小时。

4.  重复以上步骤一次。

5.  4°C，15000g离心15min，取沉淀，敞口放置5min左右至样品干燥（植物等蛋白浓度比较低的样品可以采用真空干燥器抽真空干燥5分钟左右使样品成干粉状）。

6.  将干燥后的沉淀加入酚抽提液混合至沉淀分散均匀。

7.  加入等体积的酚-Tris-HCL(7.5)饱和溶液，4°C混合30分钟。

8.  4°C，5000g离心30分钟，收集酚上层。

9.  加入5倍体积的预冷0.1M醋酸铵-甲醇溶液，-20°C沉淀1小时。

10. 4°C，10000g离心10分钟，收集沉淀。

11. 加入5倍体积的预冷甲醇，轻微混合。

12. 4°C，10000g离心10分钟，收集沉淀。

13. 以丙酮代替甲醇重复步骤11，12两遍，充分去除甲醇。

14. 4°C，10000g离心10分钟，收集沉淀。

15. 将干燥后的粉末溶解液于样品裂解液中，30°C恒温水浴充分溶解蛋白。

16. 将溶液在室温下15000g离心15min，取上清，并再次离心取上清，充分去除不容性杂质。上清即为组织的总蛋白溶液，进行蛋白浓度测定并分装后储存于-80°C备用或直接用于iTRAQ分析。

b.动物组织样本

1. 将冷冻的样品取出，直接加入适量裂解液，加入蛋白酶抑制剂（PMSF或Cocktail）使其终浓度为1mM，用移液器吹打至分散状态。

2. 冰上超声破碎，功率80W，超声0.8s，关闭0.8s，共3min。

3. 加入5倍体积的预冷丙酮震荡混合，-20°C沉淀2小时或过夜。

4. 4°C，12000g离心10分钟，收集沉淀。

5. 加入适量体积的预冷丙酮震荡混合，4°C，12000g离心15分钟，收集沉淀，重复该步骤一次。

6. 常温下干燥后，溶解于样品裂解液中，充分溶解蛋白。

7. 将溶液在室温下12000g离心15min，取上清，并再次离心取上清，充分去除不容性杂质。

上清液即为组织的总蛋白溶液，分装后储存于-80°C备用或直接用于iTRAQ分析。

2）蛋白定量

1. 按50体积BCA试剂A加1体积 BCA试剂 B(50:1)配制适量 BCA工作液，充分混匀。

2. 将0.5mg/mL蛋白标准溶液按0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20μL加到96孔板的标准品孔中，加标准品稀释液补足到20μL。

3. 加适量体积样品到96孔板的样品孔中，加标准品稀释补充到20μL。

4. 各孔加入200μLBCA工作液，37°C放置20-30分钟。

5. 使用紫外分光光度计或酶标仪测定A562吸光度，540-595nm之间的波长也可接受，根据标准曲线计算出样品的蛋白浓度。

3）蛋白还原烷基化及酶解

参考FASP[Jacek R Wisniewski, Alexandre Zougman, Nagarjuna Nagaraj and Matthias MannUniversal. Nature Methods, 2009, 6: 359 - 362]方法酶解蛋白。

1. 蛋白定量后每个样品各取100μg，采用5倍体积预冷丙酮进行沉淀，-20°C放置1小时，充分沉淀蛋白。

2. 4°C，12,000rpm离心10分钟，取沉淀真空冷冻干燥。

3. 采用50μl iTRAQ 试剂盒中的Dissolution Buffer充分溶解蛋白沉淀，加入4 μl Reducing Reagent，60°C反应1小时。

4. 加入 2μl Cysteine-Blocking Reagent，室温反应10分钟，将还原烷基化后的蛋白溶液加入10K的超滤管中，12,000 rpm离心20分钟，弃掉收集管底部溶液。

5. 加入100μl Dissolution Buffer，12,000 rpm离心20分钟，弃掉收集管底部溶液，重复3次。

6.更换新收集管，在超滤管中加入50μl浓度为50ng/μl的测序级胰蛋白酶溶液，37°C反应12小时。

7. 12000rpm离心20分钟，收集酶解后肽段，在超滤管中再加入50μl Dissolution Buffer，12000rpm离心20分钟，收集管底溶液并与前次溶液合并。

4）蛋白标记

1. 将iTRAQ试剂平衡到室温，离心至管底。

2. 用150μl 异丙醇溶解iTRAQ试剂。

3. 取50μl样品（100μg酶解产物）转移到新的离心管中，加入iTRAQ试剂后室温反应2小时。

4. 加入100μl水终止反应。

5. 混合所有标记样品，涡旋振荡，离心至管底；

6. 真空冷冻干燥样品，留作iTRAQ分离鉴定。

5）2D-LC-MS/MS分析

1. 冷冻干燥后的样品用110μL 流动相A 溶液溶解。

2. 肽段分离在Agilent 1200 HPLC上进行，检测波长：紫外210nm和280nm；流速：0.3ml/min，非线性二元梯度：

3. 0-5分钟丢弃，6-45分钟每4.5分钟收集1管，46-50分钟收集成1管，总共10管样品溶液，然后将每管溶液彻底冷冻干燥。

4. 将阳离子交换分离后冻干的多肽样品重新溶解于Nano-RPLC Buffer A中。

5. 在线Nano-RPLC液相色谱在Eksigent nanoLC-Ultra™ 2D系统(AB SCIEX)进行，溶解后的样品以2µL/min的流速上样到C18预柱上（100µm×3cm，C18, 3µm, 150Å），然后保持流速冲洗脱盐10min。

6. 分析柱是C18反相色谱柱（75μm x 15 cm C18- 3μm 120 Å, ChromXP Eksigent），实验所用梯度为70min内流动相B由5%升高至35%。

7. 质谱采用TripleTOF5600系统(AB SCIEX)结合纳升喷雾III离子源(AB SCIEX, USA)，喷雾电压为2.5 kV，气帘气压为30PSI，雾化气压为5PSI，加热器温度为150°C，质谱扫描方式为信息依赖的采集工作模式下（IDA，Information Dependent Analysis），一级TOF-MS单张图谱扫描时间为250ms，每次IDA循环下最多采集35个电荷为2+到5+且单秒计数大于150的二级图谱，每次循环时间固定为2.5秒，碰撞室能量设定适用于所有前体离子碰撞诱导解离（CID），动态排除设置为18秒，约等于色谱半峰宽。