自然选择是达尔文进化论的核心思想。在自然选择的推动下，生物群体可能逐渐适应环境，提高自身适应性，从而实现进化；也可能被环境淘汰，进而导致灭绝。在自然选择和进化能力的关系上有两派学说：一派认为强选择压会增强生物的进化能力，因为强选择压保留下来的性状适合度很高，在适应环境的前提下，进化能力也会越来越强。也就是一个正向循环，适应性强，被保留，被保留的继续突变成适应性更强的。另一派认为强选择压会有损进化能力。因为选择压会清除一些有害突变，而这些有害突变控制新性状。也就是说没选择的时候所有突变都被保留，这时候的进化能力是最强的，因为进化的方向最多。自然选择学说是否会受到挑战，自然选择致使群体进化的能力究竟缘何而来？目前尚不清楚。为了解释这一问题，Andreas Wagner交出了自己的答卷。
文章信息
- 题目：Selection enhances protein evolvability by increasing mutational robustness and foldability
- 期刊和时间：SCIENCE，2020.12.4
- 作者和单位：通讯作者为瑞士苏黎世大学Andreas Wagner教授，其实验室主要关注基因组和进化生物学。本文包括通讯只有三位作者，可想而知并不是以庞大的工作量取胜，而是其他的innovations。
研究背景
- 强选择压可能通过保留利于进化的突变，从而加速祖征到衍征的进化；但强选择压也可能通过消除弱有害突变减缓群体进化能力（新特性累积少了）。
- 因此作者希望设计实验来证明究竟是强选择压还是弱选择压会导致蛋白进化能力的改变。
研究对象
首先要明确的是实验目的：探究选择压与进化能力的关系。那么究竟使用什么材料更好呢？作者想到了黄色荧光蛋白和绿色荧光蛋白，二者结构差距很小，仅需几个关键位点结构变异就可以转化，从而构成“进化”关系。因此作者转化了黄色荧光蛋白到大肠杆菌，并对其施加强(S)/弱(W)/无(N)三种YFP选择压，观察后代的黄色荧光强度（阶段一，phase1）从而构建收到选择压的三个群体。当然，构建选择压群体不是目的，目的在于之后的绿色荧光蛋白进化速度的验证。在阶段一的基础上，对同一批大肠杆菌进行绿色荧光蛋白的定向选择（阶段二，phase2），作者希望能够看到YFP向GFP进化的过程，因此筛选对象换成了GFP。试验全程分选大肠杆菌用的是FACS技术，可以根据荧光表型筛选出单个大肠杆菌细胞。
研究结果
1.强选择压提高蛋白质进化能力
作者首先观察了阶段一和阶段二培养下的大肠杆菌的荧光强度变化。
注解：横轴是代数，纵轴是荧光强度相较于祖先YFP的倍数。经过阶段一的选择，在不同选择压下大肠杆菌荧光强度发生了变化，强选择压下有利突变快速固定。弱选择压下，大肠杆菌黄色荧光轻微下降，总体围绕1呈现出有害突变-选择的平衡。无选择的大肠杆菌荧光强度下降到祖先的5%，表明有害突变在积累（B图）。而后作者对阶段一每一代YFP进行了三代测序（SMRT），发现在遗传多样性上S<W<N（supplemental FigS1和S2：本文附加材料地址如下，https://www.science.org/doi/suppl/10.1126/science.abb5962/suppl_file/abb5962_zheng_sm.pdf）。因此作者一度以为弱选择会通过累计足够多的变异从而使黄色荧光更快进化成绿色荧光。但是，二阶段选择绿色荧光进化速度却是S>W，绿色荧光强度更强（C图）。强选择压反而更能促进衍征的进化。
2.对祖先性状施加强选择压利于新功能突变的固定
为什么强选择导致了更强的进化能力呢？作者用三代测序测量了阶段二中每一代大肠杆菌的YFP的遗传多态性，热图颜色代表出现频率。发现G66S和Y204C两个突变在每一代都会出现（Fig2最左图）。Fig2中的完整热图在下方，能看到强选择S，弱选择W和无选择N下G66S和Y204C两个突变都会出现。因此作者将G66S和Y204C视为universal mutations，和剩下二十个突变都可能导致了黄变绿，这两个就是其余突变的基础。经过测序发现突变频率也在积累，也就是右图的C。所以作者单独构建了两个单突，也构建了YFP双突，也就是U。G66s明显将黄色荧光蛋白广谱转移到了绿色。之前20个其余的突变中有9个配合U也能改变激发光。回到C，作者也观察到两单加一双（G66s，Y204C，U）在阶段二中快速积累，积累速度在强选择下明显更快。但是两单加一双的积累也引发了一个悖论：明明阶段一有选择时整体突变会更少，但是在阶段二仍然能快速积累突变。作者认为在强选择压下，群体发生的突变很有可能是更加稳定的，稳定的蛋白会导致进一步稳定的突变。作者显然是支持自然选择和进化能力的关系的假说一。
3.强选择压比弱选择压能带来更强的突变稳定性和更高的可折叠性
为了验证这一假说，就要想办法验证三个选择压下的群体蛋白质的折叠和稳定性情况。因此作者在阶段一之后诱发突变了三个群体并且测定了突变后的黄色荧光强度。希望从蛋白抵抗突变的角度证明其稳定性。
注解：A图是诱变后的黄色荧光相比于未诱变时的比值。高选择压下群体S的荧光值折损最小，说明此时群体更不容易被诱发突变，稳定性更高。且诱导后发黄色荧光和绿色荧光的个体比例，也呈现出强选择压下更稳定的情况，即B图。说明的确强选择压能带来更强的稳定性来抵抗突变，不仅是质量也是数量上的。也就是说决定变色的突变越稳定，越不容易受环境影响，在选择时被保留的几率越大。这也是为什么强选择压群体中两个突变加速积累的原因：因为群体更稳定了。而蛋白质稳定性很大程度上受到了可折叠性的影响。而折叠的效率和稳定性可以通过可溶蛋白浓度和复性速率来衡量。因此作者测量可溶蛋白的数量和不可溶蛋白的比例（C和D图），结果的确在强选择压群体S下可溶蛋白数量最多，不可溶蛋白比例相反。E图复性率上同样是强选择压群体更快。因此，选择压通过增加蛋白可折叠型和复性率提高稳定性。
为了进一步证实复性率和蛋白稳定性的关系，作者在众多促进折叠性的YFP中找到了四个已经报道的位点：F47L, F65L, V164A, and I172V。同时也发现了一个突变：K102E在阶段一之后相对于弱选择和不选择频率也达到了很高。将五个突变的突变体蛋白去折叠之后检测其复性的速度（Fig4A），结果发现五个突变体的复性率都快于祖先YFP。五个蛋白突变体都有助于提高YFP的复性能力。此外，对于随机突变的稳定性也能反映蛋白质的稳定性。作者对这五个突变体利用PCR引入了随机突变，观察荧光在引入随机突变前后的比例。刚刚提到的五个促进折叠性的蛋白中，四个蛋白的荧光值都超过了祖先的恢复程度。只有K102E与祖先的荧光显著程度小（Fig4B）。至此，作者找到了影响折叠能力的突变位点，并且证明了这些位点与蛋白稳定性的关系。
4.蛋白可折叠性的提高加速其自身进化
将进化能力的增加只归结为蛋白稳定性的增强显然是不够深入的。需要进一步研究稳定性的增强如何影响进化能力。完成一个从what到how的过程。作者将分别从有益突变和有害突变两个角度衡量进化。
注解：在每一代大肠杆菌选择过程中引入随机突变，强选择压的群体中，高于祖先的绿色荧光细胞的比例比其他两个选择压更高（A图）。也就是说在蛋白折叠性增强，稳定性增强的同时，还提高了荧光蛋白的强度。也就是说强选择压导致蛋白稳定性增强的同时，也会选择出荧光强度的控制位点，这个过程很可能发生selective sweep增加绿色荧光蛋白的位点多态性。既然能引发SS，那么这些位点就可能既关联于稳定性，又关联于荧光强度。那该如何量化一个位点关联两种性质的比例呢？作者在这里定义了稳定性的比例。1减去稳定性所占的比例，剩下的就是控制荧光的比例。据此算出了五个影响折叠能力位点对两个性状的贡献比例。我们能看到稳定性的贡献还是占多数的（B图）。也就是说绿色荧光性状的快速积累更大程度得益于稳定性增强，而非黄色荧光的加深。
作者又提出假设，既然增强稳定性的突变会促进有益突变保留，但也会保留下有害突变。 有益突变如果掩盖了有害突变，则后者也会被保留。但是绿色荧光的快速富集，且黄色荧光没有富集那就说明一点，有害突变没有被保留，而是被清除。为了证明强选择压会消除有害突变，作者对YFP引入了无义突变，观察阶段一对YFP的选择会如何影响无义突变的频率。结果发现无义突变在两个有选择压的情况下都减少了（Fig6A）。这里的图A，横轴是代数，纵轴是不稳定突变的频率。说明有害突变在被消除。同时作者用FoldX算法预测了蛋白质不稳定突变的比例（Fig6C），发现两个选择压的情况下，不稳定突变频率下降。至此，作者证明了突变稳定性的增强消除了有害突变。
最后我们总结一下整篇文章：
为了探究选择如何影响进化能力。作者发现强选择压会导致进化能力提升。
- 进化能力的提升来自于突变稳定性和可折叠性的增强。
- 突变稳定性的增强促进了适应性突变的积累，消除了有害突变。
- 得益于这些能够增强蛋白质稳定性的位点，群体能够保留核酸多态性，从而顺利进化度过适应性低谷。
- 最终结论一句话：想要完成进化，与其吞吞吐吐，不如大刀阔斧。
科学的尽头总有点哲学内味儿~
参考信息：
1.Zheng J, Guo N, Wagner A. Selection enhances protein evolvability by increasing mutational robustness and foldability. Science. 2020;370(6521):eabb5962. doi:10.1126/science.abb5962
