视频来源：https://www.youtube.com/watch?v=WVKlRlCpSjA
RNA sequencing RNA高通量测序技术：了解各种比较条件下，所有基因表达情况的差异
如：正常组织与肿瘤组织、药物治疗前后表达差异、不同发育阶段不同组织之前的差异
最常用：所有mRNA表达量的差异、mRNA可变剪接的差异、融合基因、SNP
RNA-seq测序方法
1. 去除核糖体RNA（rRNA，占抽提总RNA的绝大部分，95%占人体），mRNA只占2-3%，剩下的是ncRNA
-rRNA在人类中很保守，在各组织之间表达量很稳定，测rRNA的意义不大，一般测mRNA
-illumina Truseq RNA 建库方法：
（1）利用带poly（T）探针的磁珠与总RNA进行杂交，吸附其中带poly（A）尾巴的mRNA（高等生物的mRNA都有Poly（A）尾巴），回收磁珠，并把polyA尾巴的mRNA洗下来
（2）将洗脱下来的mRNA用镁离子（Mg2+）溶液进行处理，把mRNA打断
（3）将打断的mRNA片段用随机引物进行逆转录
（4）逆转录合成第一链cDNA后，再合成出第二链cDNA——成为双链cDNA
（5）在双链DNA两端加A碱基，并接上“Y”型的接头，经过PCR扩增，便成为了可以进行分析的mRNA文库
（6）在Hiseq测序仪上进行测序
做 Truseq RNA-seq文库起始总RNA质量要求
1. 在mRNA的大部分片段是完整的状态下，才能有比较好的建库效果
（若mRNA发生降解，磁珠会吸附靠近3‘端的那些断片（而非完整的mRNA））
会洗脱掉一部分的mRNA数据，影响后期的数据分析工作（不准确）
2. 建议在建立文库前进行一次总质检Bioanalyzer
Bioanalyzer 检测18S 28S的电泳峰是否高、尖，来判断RNA的质量——越高越尖，代表降解越少，完整度越高
RNA integrity number（RIN值） 最高十分，最低零分，代表RNA完整度的象征（8.0以上比较好建库）
RNA seq的生物信息学分析
1. 将测到的mRNA片段 mapping（比对）到基因组上（看5'端与3'端片段的数量，也可以判断降解的情况）
RNA 表达量差异分析
1. 表达量差异相对定量值：Read per kilobase of exon model per million mapped reads（RPKM值）
——每一百万条可以比对到基因组上的read当中，有几条是可以比对到某个特定基因的，此数值再除以外显子的长度，得到的最终比值
RPKM含义：某个基因，所表达的mRNA片段与所有被测到的可以Mapping（比对）到基因组上的片段进行比较，因为建库当中mRNA被镁离子溶液打断过，所以要再除以一次外显子的长度（外显子越长越容易被测到，进行一次修正）
RNA表达差异火山图
1. 两个样本RNA的表达量的对比
2. 横轴： 某个基因的表达量是上升，还是下降了 纵轴：这种差异的置信程度 每一个点：同一个基因的mRNA表达量的变化
3. 超过蓝色部分的置信程度很高，可以相信（红色部分）
RNA表达聚类分析：
1. 横轴样本，纵轴基因（样本会根据亲缘进行分类，建树，每个群体内部有相似的表达特征）
Gene ontology 分析（GO分析）
1. 国际化的 基因功能分类体系 ——一整套动态更新的标准词汇、严格定义的概念——全面概括任何生物中基因、基因产物的属性
主要描述基因的三个属性：
1. 此基因参与的生物过程
2. 此基因的产物的功能
3. 基因产物在细胞器中的空间定位
通路分析（Kyoto encyclopaedia of genes and genomes,KEGG）：公认、权威的基因功能数据库
