荧光定量PCR（一）— 基础介绍

1.荧光基础

1.1 荧光的产生

当有入射光照射物质时，其分子会吸收入射光的能量从而受到激发使得其电子由低能级跃迁至高能级，此时处于激发态的分子其结构并不稳定，会通过跃迁而失去能量返回基态，这个过程会伴随着荧光或者磷光的产生。如图所示

image.png

1.2 荧光光谱

所有荧光物质都具有两个特征光谱，也即激发和发射光谱。

激发光谱：固定荧光的发射波长（测定波长）不变，记录荧光强度与激发波长之间的谱图称为激发光谱，反映某一固定的发射波长对激发光的依赖关系，也即反映了激发光的效率。
发射光谱：固定荧光的激发波长不变，记录荧光强度与发射波长之间的谱图称为发射光谱，反映某一特定激发波长下测得的荧光波长分布。

通常情况下，物质的发射光波长总是大于其激发光波长，这是因为，物质在收到激发的过程中，存在着一定的能量损失。激发和发射光波长的差值称之为斯托克位移。

image.png

1.3 荧光淬灭

荧光物质分子与溶剂或溶质分子之间所发生的导致荧光强度下降的物理或者化学作用过程
荧光淬灭的形式很多，机理也比较复杂。主要有如下几种类型

碰撞淬灭：也称动态淬灭。它指的是处于激发单重态的荧光分子M与淬灭剂分子Q相碰撞，使M释放热量给环境，以无辐射的形式跃迁回基态，产生淬灭作用。采用此种淬灭形式的有分子信标等。
生成非荧光化合物：也称为静态淬灭，它指的是基态的荧光物质与淬灭剂反应生成非荧光的化合物，导致荧光的淬灭。
能量转移淬灭：当淬灭基团吸收光谱与荧光基团的荧光光谱有重叠时，处于激发单重态的荧光基团的能量就可能转移到淬灭基团上，从而在更长波长处释放荧光或者淬灭。如Taqman 探针及水解探针等。
氧的淬灭：O2可以说是荧光和磷光的最普遍存在的猝灭剂。对于溶液磷光来说，氧的猝灭作用是十分有效的，通常观察不到溶液的室温磷光现象。而对于溶液荧光来说，不同的荧光物质或同一荧光物质在不同的溶剂中，对氧的猝灭作用的敏感性有所不同

1.4 常用荧光定量PCR仪兼容表

image.png

2.荧光定量PCR

荧光定量PCR技术是为了测定样本中特异的PCR片段相对及绝对量，是一种测定特异的PCR片段含量的方式。如测定病人样本中病原体的含量、实验样本中某一特定的mRNA的含量等。为了达到高效反应，应将实时PCR应用的引物设计为能生成短的扩增子。常用的方法有SYBR Green的荧光染料法和TaqMan探针法，两种方法的特点及应用如下表：

image.png

2.1 荧光基团的选择原则

由于目前不同荧光定量PCR仪的原理和提供的检测光光谱范围的差异，因此在选择探针的发光基团和淬灭基团时一定要根据所用的仪器型号设置的可检测的荧光信号范围内选择（探针法可连接我们的荧光定量PCR试剂盒的编号及对应的机器型号）

常与5’端相结合的荧光报告基团：
FAM（6-羧基荧光素）
TET（四氯-6-羧基荧光素）
JOE（2，7-二甲基-4，5-二氯-6-羧基荧光素）
HEX（六氯-6-甲基荧光素）或VIC
常与3’端相结合的荧光淬灭基团：
TAMRA(6-羧基四甲基若丹明)
DABCYL（4-（4-恶烷氨基苯偶氮）苯甲酸）
BHQ

image.png

2.2 荧光基团的种类

2.2.1 荧光素类

Fluorescein
标准荧光素之一，在其基础上进行结构改造，可产生一系列荧光素衍生物。Fluorescein适用于Argon-ion Laser的488nm光谱线，有相对高的荧光吸收，较好的荧光产率以及良好的水溶性。与其他荧光素类衍生物一样，Fluorescein具有光淬灭率高，pH敏感性强与发射波谱宽的缺点。主要应用于聚焦激光扫描微阵列（Confocal laser scanning microscopy）和流式细胞计应用（Flowcytometry）

荧光素
FITC
异硫氰酸荧光素，Fluorescein isothiocyanate，是荧光素衍生物的一种，纯品为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水和酒精溶剂。分子量为 389.4，最大吸收光波长为490～495nm，最大发射光波长为520～530nm，呈现明亮的黄绿色荧光。FITC在冷暗干燥处可保存多年，在水中易变坏，不能长久保存。是目前应用最广泛的荧光素。其主要优点是人眼对黄绿色较为敏感。 FITC的异硫氰酸基能与氨基反应，可用于标记氨基修饰DNA，一旦形成，产物极为稳定。适用于Argon-ion Laser的488nm光谱线，Abs/Em=492/519nm（pH=9.0）。与蛋白的结合力也强。FITC有两种异构体5-FITC和6-FITC，其中前者在效率、稳定性与蛋白质结合力等方面都更优良更经常使用。FITC-Oligo广泛用于杂交探针；FITC-多肽用于Edman降解蛋白测序；FITC也经常被用于蛋白电泳检测（即使是毛细管电泳）和荧光能量激发转移测试。

FITC
FAM
羧基荧光素，Carboxyfluorescein，绿色荧光，是荧光素衍生物的一种，5-FAM较6-FAM更经常使用。5-FAM（NHS）广泛存在于荧光标记试剂盒。与FITC相比，FAM与氨基反应更快，产物也更稳定，但FITC结合蛋白的量更大且进程更易于控制。FAM也适用于Argon-ion Laser的488nm光谱线，Abs/Em=492/518nm（pH=9.0），具有荧光素衍生物的普遍特性，在水中稳定。5-FAM主要应用于DNA自动测序中，标记其中的d/ddCTP（PE公司），也经常用于PCR产物定量，核酸探针等。

FAM
5-FAM、6-FAM、FITC
都是荧光素标记（Fluorescein），5-FAM与6-FAM互为异构体：而FITC则在与oligo的连接方式上（硫脲键）有别于前者（酰胺键），但它们的发色团均为荧光素，通常使用中没有区别。因此可由Eclipse或BHQ系列染料组成一套双标记荧光探针用于多重PCR。
TET
四氯-6-羧基荧光素，Tetrachloro fluorescein，是荧光素衍生物的一种。TET以及HEX均是在FAM基础上加以改进的，氯原子使FAM的吸收波长与发射波长值都产生一定的红移，并在一定程度上减弱了pH敏感性。TET也适用于Argon-ion Laser激发光源，Abs/Em=521/536nm。

TET
HEX
六氯-6-甲基荧光素，Hexachloro fluorescein，是荧光素衍生物的一种，原理类似于TET，适用于Argon-ion Laser激发光源，Abs/Em=535/556nm。TET，HEX，FAM和TAMRA可配合用于DNA自动测序中，其中TET用于标记d/ddATP，HEX用于标记d/ddGTP或d/ddATP。

HEX
JOE
2，7-二甲基-4，5-二氯-6-羧基荧光素，是荧光素衍生物的一种，6-JOE更被广泛使用。JOE荧光产量高，pH敏感性弱，适合于标记蛋白。6-JOE也适合于Argon-ion Laser激发光源，Abs/Em=520/548（pH=9.0）。常用于DNA自动测序，标记d/ddATP，也经常被用于进行电泳检测与PCR产物定量。

JOE

2.2.2 罗丹明类染料

R110
由三苯甲烷衍生的标准荧光素（Reference standard）之一，在其基础上进行结构改造，即可产生一系列罗丹明类衍生物。与Fluorescein类衍生物相比，罗丹明类荧光素具有更强的光稳定性，更高的荧光产量以及更低的pH敏感性。罗丹明类荧光素极为适合于标记寡核甘酸，但蛋白会引起大多数罗丹明类荧光素的荧光淬灭，故大多数不适宜用于标记蛋白。R110被用于DNA自动测序。

R110
TAMRA
全称羧基四甲基罗丹明，即Carboxytetramethylrhodamine，是罗丹明类荧光素衍生物，6-TAMRA被广泛使用。TAMRA是少数几个能用于标记蛋白的，6-TAMRA适用于Argon-ion Laser激发光源，Abs/Em=547/573nm（Ph=8.0），6-TAMRA（NHS）常用于荧光标记试剂盒中。6-TAMRA主要用于DNA自动测序中

TAMRA
Texas Red
Texas Red是一个长波长荧光素，与Fluorescein几乎没有波谱重叠，只适合于Ar-KrLaser的568nm光谱线或He-NeLaser的594光谱线，比Tetramethylrhodamine和LissamineTM Rhodamine B波长更长，荧光量更高。Texas Red在荧光微阵列和流式细胞计中更被经常作为第三波长标记(Third labels)

Texas Red

2.3 荧光淬灭基团

由淬灭基团TAMRA、Eclipse或BHQ系列染料组成的双标记荧光探针常常被用作水解探针(Hydrolysis Probes)，或称"TaqMan"探针，用于Real Time PCR实验。由于这些淬灭染料的光谱学性质不同(见下图)，作为淬灭基团使用时的特点也不同，现说明如下：

TAMRA为荧光染料，在淬灭报告基团的同时，自身会在更高波长处发射荧光，此发射荧光会对报告基团的检测造成影响，探针荧光本底 (Background)相对较高。而Eclipse及BHQ系列为非荧光染料，淬灭报告基团，但自身不发射荧光，因此，探针荧光本底低，信噪比更大，检测灵敏度更高。
淬灭基团对报告基团的淬灭有赖于二者的光谱迭盖(Overlapping)，也即报告基团的荧光光谱应与淬灭基团的吸收光谱相交搭。对比TAMRA、Eclipse及BHQ系列染料的吸收光谱，可见TAMRA的吸收光谱覆盖范围窄，可与之匹配的报告基团种类比较少；而Eclipse则具有更宽的吸收范围(390 nm-625 nm)，可淬灭的报告基团种类很多，如FAM、HEX、TAMRA、ROX等均可；组合使用的BHQ系列染料的吸收光谱覆盖范围则更广，从430 nm一直到近红外，可淬灭的报告基团种类更多 (对Cy3、Cy5等的淬灭效果都很好)。因此可由Eclipse或BHQ系列染料组成一套双标记荧光探针用于多重PCR(Multiplexing PCR)。

image.png