A single-cell atlas of the peripheral immune response in patients with severe COVID-19
影响因子： 36.13PMID：32514174期刊年卷：Nat Med 2020 07; 26（7）
医学一区 细胞生物学 Q1 2/190
DOI：10.1038 / s41591-020-0944-y
COVID-19与外周免疫活性的改变有关，包括可能由一部分炎性单核细胞，淋巴细胞减少和T细胞衰竭产生的促炎细胞因子水平升高。为了阐明在严重COVID-19中可能导致免疫病理学或保护性免疫的外周免疫细胞途径，作者应用了单细胞RNA测序（scRNA-seq）来分析7例因COVID-19住院的患者的外周血单核细胞（PBMC） ，其中四人患有急性呼吸窘迫综合症，另外六人健康。作者发现COVID-19中外周免疫细胞表型的变化，包括异源干扰素刺激的基因，HLA II类下调和正在发展的嗜中性粒细胞群体，该群体与发生在需要机械通气的急性呼吸衰竭患者中出现的浆母细胞密切相关。重要的是，作者发现外周单核细胞和淋巴细胞不表达大量促炎性细胞因子。作者共同提供了对严重COVID-19的外周免疫应答的细胞图谱。
主要结果
七个住院患者用逆转录聚合酶链式反应8个外周血样品（RT-PCR）确认SARS-CoV-2感染和6个健康对照组。七名患者均为男性，年龄在20至80岁以上。作者在症状发作后2到16天之间收集了样本；健康对照者无症状，4例男性和2例女性，年龄30-50岁（图1a和扩展数据图1）。从经诊断患有急性呼吸窘迫综合征（ARDS；图1a）的通气患者中收集八个COVID-19样本中的四个。对一名患者（C1）进行了两次采样：症状发作后第9天，仅需补充氧气，插管后症状发作后第11天。三名患者在采样前的某个时候接受了阿奇霉素，这具有潜在的免疫调节作用13（图1a）。五名患者在医院接受瑞姆昔韦治疗，其中四名在取样之前。
图1：COVID-19患者外周血的成浆细胞扩增和多个固有免疫细胞亚群的消耗
1. 测序总概况
作者对44,721个细胞进行了测序，每个样品平均测序了3,194个细胞（补充表1）。UMAP确定了30个聚类（图1b，c）。作者计算了每个簇的最高差异表达（DE）基因，以使用各自的细胞身份手动注释簇（图1b，c，补充表2和方法）。表明COVID-19患者与对照之间存在明显的表型差异，主要存在于单核细胞，T细胞和自然杀伤（NK）细胞中（图1b，c）。
2. COVID-19驱动的细胞类型比例的变化
接下来，作者量化了COVID-19驱动的细胞类型比例的变化。COVID-19患者的一些先天免疫细胞亚群被耗竭，包括γδT细胞，浆细胞样树突状细胞（pDC），常规树突状细胞（DC），CD16 +单核细胞和NK细胞，后三种细胞类型仅在来自ARDS患者的样本（图1d）。发烧后或症状发作后的时间并不能解释这些趋势（S2）。作者还注意到COVID-19患者的成浆细胞比例增加；这些水平在ARDS患者中最高（图1d），这表明更严重的情况下可以用一个更强大的体液免疫应答，类似以前的报告相关联14，15。来自COVID-19患者的周围成浆细胞似乎没有共享特定的免疫球蛋白V基因（图S3a）。
3. 发现新型细胞
最后，仅在ARDS患者中，作者称之为“正在发展的嗜中性粒细胞”的新型细胞群才显著增加（图1d）。这些细胞表达编码中性粒细胞颗粒蛋白的几种基因（例如，ELANE，LTF和MMP8；见图4和补充表2和3）16，但不表达编码中性粒细胞标志物的基因，例如FCGR3B和CXCR2（补充表3），并且在UMAP嵌入中占据了与成浆细胞相似的空间，而不是经典的中性粒细胞（图1c）。此外，它们包含表达细胞CEACAM8，ELANE和LYZ*，类似于最近描述嗜中性粒细胞前体细胞17，18，这表明这些细胞代表在各个发育阶段的中性粒细胞。
4. 单核细胞的更多亚群
接下来，作者分析了单细胞的更多亚群，因为在COVID-19患者中，该细胞簇区域似乎最强烈地重塑（图1b，c）。单核细胞簇区域减小表明CD14 +单核细胞发生了强烈的表型转移，而CD16 +单核细胞却在消耗（图2a，b）。作者首先检查编码先前报道通过在COVID-19循环单核细胞产生的炎性细胞因子的基因的表达5，6。值得注意的是，作者没有发现促炎性细胞因子基因TNF，IL6，IL1B，CCL3，CCL4的大量表达。外周单核细胞产生的CXCL2或CXCL2（图2c），表明外周单核细胞对COVID-19中的假定细胞因子风暴没有贡献。（备注：前一篇文献中否定了这种说法）
图2：单核细胞中强烈的HLA II类下调和I型干扰素驱动的炎症信号是SARS-CoV-2感染的特征
为了确定基因表型驱动重塑COVID-19样品中，作者确定了DE基因，途径和上游调节由每个COVID-19样品的细胞进行比较，以所有健康对照组（图的细胞2D和补充表格4 - 24）。编码HLA类II分子8个基因的至少六个COVID-19样品相对于健康对照组是下调的（图2d），与其他研究一致19，20。通过表达所有HLA II类编码基因对单个细胞进行评分显示，这种下调在所有COVID-19患者中均显著，但在通气依赖患者中可能更为明显（图2e，f和补充表25）。HLA II类下调反映在差异调节的基因途径中，包括减少树突状细胞与自然杀伤细胞之间的串扰（图2g和补充表11）。B细胞中也注意到HLA II类下调（扩展数据图3b，c和补充表10），并且下调的程度在老年患者中趋于更大（扩展数据图4）。非经典HLA I类基因HLA-E和HLA-F也被下调程度较小且样品较少，而经典HLA I类基因HLA-A，HLA-BHLA-C和HLA-C并未持续上调或下调（图2f）。
此外，至少一个COVID-19样品中的CD14 +单核细胞上调了32种干扰素（IFN）刺激的基因（ISG），但这种IFN信号在所有COVID-19样品中均不一致（图2d和补充表4） 。CD14 +单核细胞中上游调节因子的分析显示，相对于其余COVID-19供体，供体C2，C3和C7中没有预测的IFN和IFN调节因子（IRF）活性（图2h）。在其他细胞区室（扩展数据图中观察到类似的模式5和6和补充表格18 - 24）。为了对此进行正交分析，作者通过数据集中已知ISG的表达对单个CD14 +单核细胞评分，并再次在供体C2，C3和C7中看到最小的ISG可识别签名（图2i和补充表25）。ISG差异的特征不能通过通气或ARDS来解释（图2h，i），但是较高的ISG分数倾向于与年龄呈正相关，而与发烧时间之间呈负相关（图2j）。
5. COVID-19样品中的T和NK淋巴细胞
先描述T和NK淋巴细胞存在差异，然后分析差异基因及通路富集分析，最后回归到表型。
接下来，作者分析了COVID-19样品中的T和NK淋巴细胞。TMAP和NK细胞的UMAP嵌入确定了CD4 + T，CD8 + T和NK细胞的细胞表型的显著差异（图3a，b）。作者发现，CD56dim NK 细胞，一般认为通过细胞介导的细胞毒作用有助于抗病毒宿主防御21，22，是在呼吸机依赖患者的主要消耗殆尽，而CD56bright NK细胞，这被认为是IFN-γ的强大的生产者和肿瘤坏死因子α 23，所有COVID-19样品中显著耗尽（图3c中）。此外，作者鉴定出一群增殖性淋巴细胞细胞，在大多数COVID-19患者中似乎增加（图3c）。由于SARS-CoV-2感染已与细胞毒性淋巴细胞衰竭有关10，作者通过T细胞和NK细胞分析了编码经典衰竭标志物的基因的表达。然而，没有明显证据表明COVID-19患者的CD8 + T细胞衰竭，尽管CD4 + T细胞中的衰竭标志物似乎升高，但这些变化并不显著（扩展数据图7和补充表25）。根据LAG3的表达，大多数COVID-19患者的NK细胞出现衰竭，PDCD1和HAVCR2（图3d）。类似于作者在外周单核细胞中的观察，作者没有检测到T或NK细胞促炎性细胞因子基因的大量表达（图3e和图5和8的扩展数据）；这再次表明，外周血白细胞促炎细胞因子的转录不太可能是COVID-19中假定的细胞因子风暴的主要因素。
图3：在COVID-19中NK细胞衰竭和IFN应答的异质性模式
接下来，作者从相对于健康对照的COVID-19患者的每个样本中计算了T和NK细胞DE基因，并使用这些基因来鉴定富集的基因途径和上游调节剂。NK细胞在COVID-19患者之间表现出明显的异质反应（图3f和补充表7）。最常见的下调基因包括FCGR3A，AHNAK和FGFBP2，它们与周围NK细胞成熟度有关24。最常用的上调基因包括的ISG和NK细胞活化基因如PLEK和*CD38 *25，26。作者观察到CD4 +和CD8 + T细胞中DE基因具有相似的异质性，其中最常见的上调基因是ISG（扩展数据图5和补充表8和9）。
对预测的上游调节的分析表明，在NK细胞，CD4 +和CD8 + T细胞中，一半的COVID-19分布图样本中都没有明显的强烈的IFN驱动反应（图3g，图5和6的扩展数据以及补充表格21 - 23）。由于干扰素反应的最近的报告说COVID-19在这种反应减弱的重要性，27，28，作者评估ISG上调在不同的细胞类型，以确定是否进行的ISG协调所有细胞类型或个人之间（图表示3H）。尽管大多数供体在给定的细胞类型（例如CD14 +单核细胞中的IFI27）中某些ISG上调，但通常ISG上调在细胞类型内或受试者之间并不统一（图3h）。此外，作者发现很少有细胞因子在大多数COVID-19患者之间上调是一致的（图3i）。这些结果共同表明COVID-19中的异质性外周免疫激活。
接下来，作者分析了浆母细胞和发育中的中性粒细胞的表型，它们似乎与降维在表型上相关（图1c）。实际上，当仅分析这些细胞类型时，正在发育的嗜中性粒细胞似乎从浆母细胞呈线性投射，表明这两种细胞类型之间存在连续的细胞表型（图4a）。在发展中的中性粒细胞中，细胞的复杂性（每个细胞测序的基因数除以每个细胞的唯一分子标识符（UMI））并不高，这使得这些细胞不太可能是多重体（扩展数据，图9）。）。这些细胞也不太可能代表具有吞噬B细胞的粒细胞，B细胞是吞噬性淋巴细胞组织细胞增多症（HLH）的特征，可以由严重的急性感染触发，因为这些患者没有HLH的临床特征。
图4：中性粒细胞的发育是重度COVID-19患者的特征，可能与成浆细胞有所区别
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6.RNA velocity分析细胞分化轨迹，确定细胞类型改变的原因
为了分析是否有这两种细胞类型之间的任何过渡，作者通过RNA velocity分析29，30。出乎意料的是，该分析表明细胞表型的线性连续体代表了从浆母细胞到发育中的中性粒细胞的分化桥梁（图4a）。在所有ARDS患者中均观察到该成浆细胞-嗜中性粒细胞表型谱，并且该谱与规范中性粒细胞的转录动力学无关（图S10）。沿着这个分化桥的细胞失去了编码规范性成浆细胞标记CD27，CD38和TNFRSF17的基因的表达，而依次获得了编码初级（DEF3A，ELANE和MPO），次级（CHI3DL1，LCN2和LTF）和第三级（MMP8，MMP9和CAMP）中性粒细胞颗粒蛋白，类似于典型的中性粒细胞发育（图4b）。推断潜伏时间的恢复（仅基于细胞的转录动力学）也暗示了从浆母细胞到发育中性粒细胞的连续性（图4c）。尽管此连续体开始时的细胞是由Ig基因的表达定义的，但嗜中性粒细胞标志物（如CSF3R和MNDA）（编码髓核分化抗原）（潜伏时间）上调（图4d）。
淋巴细胞向粒细胞的分化过程并非没有先例。类似的转变已经从B细胞来描述的巨噬细胞或粒细胞，和C /增强子结合蛋白（EBP）转录因子家族已经在控制这种转分化有牵连31，32。两个C / EBP家庭成员，CEBPE和CEBPD，髓细胞性和粒细胞的两个已知驱动程序命运33，34，有选择地通过沿着分化桥（图细胞的两个簇表示图4e中，f）; 从CEBPE到CEBPD的过渡概括了小鼠中性粒细胞的发育35。总的来说，作者观察到正在发展的嗜中性白细胞种群可能是严重COVID-19感染中ARDS的特征。作者的数据表明，这些细胞可能源自浆母细胞，但它们也可能代表来自紧急粒细胞生成的发展中性粒细胞36。
局限性:
作者的样本量很小，仅对外周血进行了评估，患者的临床表现时间有所不同，这可能会影响其转录情况。
患者用的抗生素阿齐霉素，已经公知的免疫调节活性处理13，而另一子集用的抗病毒remdesivir，其靶向病毒RNA依赖性RNA聚合酶处理37，38并且尚不具有直接的免疫调节作用。
需要进一步的研究以进一步定义在转录水平和表型水平上ARDS设置中观察到的发展中性粒细胞群体的起源和表型。由于粒细胞通常无法在冷冻保存中存活，因此这些研究将最佳地需要重症COVID-19患者的新鲜全血样本。
总体而言，作者使用单细胞转录组学来表征严重COVID-19中的外周免疫反应。作者观察到ARDS患者中SARS-CoV-2感染的免疫细胞组成和表型显著变化，以及严重COVID-19的免疫学特征。这项工作代表了了解严重COVID-19中外周免疫的资源，并为研究COVID-19免疫学和治疗发展提供了新的方向。
scRNA-seq计算管道和分析
R软件包Seurat用于数据缩放，转换，聚类，降维，差异表达分析和大多数可视化45。对数据进行缩放和转换，并使用SCTransform（）函数识别可变基因，并进行线性回归以消除由于细胞复杂性（每个细胞的基因数量，每个细胞的UMI数量）或细胞质量（线粒体百分比）引起的不必要的变异读取，％rRNA读取）。使用可变基因进行主成分分析，并使用前50个主成分（PC）进行UMAP，将数据集嵌入二维。
接下来，来构建共享的最近邻图（SNN; FindNeighbors（）），并使用基于Louvain方法的基于图的模块化优化算法，将该SNN用于对数据集（FindClusters（））进行聚类。用于社区检测46。尽管对高质量细胞，并在基因回归上游过滤反光小区质量的，两个簇被确定，其中65％或正富集基因的100％是线粒体或核糖体来源的，并且这些簇从进一步分析中去除47，48。
Seurat执行Wilcoxon秩和检验的发现DE基因对于每个簇（FindMarkers（））和来自前一数据集进行比较的那些标记，以公知的细胞类型特异性基因决定的49，50，51，52，53，54。使用R软件包SingleR 55确认了簇注释，该软件包将每个单个细胞的转录组与参考数据集进行比较以确定细胞身份。虽然聚类通常不足以细胞毒性T细胞从NK细胞中分离12，49SingleR将簇0和11中的大多数细胞（分别为94％和76％）识别为NK细胞。实际上，这两个簇是数据集中唯一显著富集了NCAM1和FCGR3A的簇（补充表2），因此作者将其标注为NK细胞。作者还观察到簇22（其中89％的细胞被SingleR注释为T细胞）富含编码δδTCR恒定链TRGC1，TRGC2和TRDC的基因，因此作者将其注释为γδT细胞（补充表2）。）。
SingleR将簇24中的大多数细胞标记为常见的髓系祖细胞，但是该簇还包含注释为造血干细胞和祖细胞的七个不同谱系的细胞。仔细检查发现，该簇由两组细胞组成，一组表达CLC，另一组表达CD34，因此作者将其标记为干细胞（SCs）和嗜酸性粒细胞，用于下游分析。总共在簇27细胞的98％是由分拣注释为髓细胞（46％），前髓细胞（22％），CD34 -前B细胞（14％）或<Q> HSC G-CSF（17％ ）。尽管这些细胞表达了几个编码一级，二级和三级中性粒细胞颗粒蛋白的基因（例如，ELANE，MPO，LTF，CTSG，LCN2和MMP8）与第25类（手动标记并由SingleR标记为嗜中性粒细胞）不同，并且不表达像FCGR3B和CXCR2这样的典型嗜中性粒细胞标记。因为这些细胞在不同的发育阶段表现出类似于未成熟中性粒细胞和祖细胞的特征17，18，作者注释这些细胞为“嗜中性粒发展细胞”。
资料可用性
可从Wellcome Sanger研究所主办的COVID-19 Cell Atlas（https://www.covid19cellatlas.org/#wilk20）下载带有去标识的元数据和嵌入的处理后的计数矩阵。Chan Zuckerberg Initiative在https://cellxgene.cziscience.com/d/Single_cell_atlas_of_peripheral_immune_response_to_SARS_CoV_2_infection-25.cxg/上也提供了可处理的数据，供公众访问的cellxgene平台查看和探索。原始测序数据可从NCBI Gene Expression Omnibus（登录号GSE150728）获得。可以通过电子邮件将其他材料请求给相应的作者。
代码可用性
可以从GitHub（https://github.com/ajwilk/2020_Wilk_COVID）获得用于数据分析的所有脚本。
