荧光实时定量 PCR 技术 (real-time quantitative PCR，qPCR) 几乎是现代分子生物学技术中最重要、应用最广泛的核酸定量检测技术。成功的定量 PCR 实验离不开精准的实验设计和操作流程。
实时荧光定量 PCR 分析的部分实施需要经过优化以确保所有反应参数均设置精确，从而获得准确的结果。常见荧光定量 PCR 困难包括引物、探针、反应抑制和软件分析等几个方面，本篇主要为大家分享引物和探针方面的经验。
引物二聚体
引物二聚体的形成是最常见的问题之一。引物对之间的部分序列存在同源性时，可形成引物二聚体。如果在 PCR 反应过程中引物退火形成二聚体，则 Taq DNA 聚合酶可延伸二聚体，形成长于原始引物的产物，它可导致循环过程中更易出现退火错误。
Q：引物二聚体会引发什么问题？
引物二聚体对反应的影响在很大程度上取决于反应中采用的化学物质。基于荧光探针的反应受引物二聚体的影响不是很大，这是由于在引物二聚体区域极少出现探针退火及断裂的现象。此时，引物的竞争作用是需要考虑的主要问题。基于双链 DNA 结合染料的反应受引物二聚体的影响很大，由于染料的结合方式为非特异性的，由此可导致反应过程中监测到的荧光信号增强。这可相应改变 Ct 值，使结果出现偏差。
Q：怎样确定是否存在引物二聚体？
凝胶电泳是显示引物二聚体的一种极佳的方法。引物二聚体在凝胶的底部形成扩散条带，通常位于 100 bp 以下。单独采用凝胶电泳分析进行验证的缺点在于，其灵敏度最低仅达到纳克级，因此可能无法得出结果。
熔解曲线也是一种显示引物二聚体的放法。如果扩增具有极好的特异性，则实时荧光定量 PCR 板上每个反应孔的解离曲线将出现一个较窄的单峰。引物二聚体的荧光强度较低，呈较宽的「波形」，显示其在 70 °C 左右熔解（见图1.）。
图 1. 熔解曲线中突出显示了引物二聚体效应
Q：怎样设计和优化实验避免出现引物二聚体？
最好在引物设计阶段就采取简单的预防措施，从一开始即避免二聚体的形成。如果出现了引物二聚体，有许多方法可以减少或消除反应中的引物二聚体。
- 首先是优化热循环条件，这主要是提高退火温度。大多数情况下，两步循环（由 95 °C 变性步骤直接进入 60 °C 退火和延伸步骤）有利于强效扩增，因此引物设计时设定的成功退火温度为 60 °C。
- 可降低引物浓度，甚至采用不同的正向引物和反向引物的比值也有一定的帮助。大多数情况下，每条引物的理想最终浓度为 200 nM，但如有需要，可将浓度降至 60 nM。
- 镁的最佳浓度一般约为 3 mM。高于此浓度易形成引物二聚体。
- 如果未对引物形成二聚体的倾向进行评估，则应补充评估并考虑重新设计（如有需要）。通常情况下，最好使用热启动 DNA 聚合酶，并在冰上进行反应。
- 在理论上，针对同一靶点应同时检测多个引物组。这实际上可以节省大量时间，因为如果这些引物中的一个能立即发挥作用，则可以减少花费在优化过程上的时间。
引物和探针的储存
引物和探针储存不当可导致降解及特异性丧失，进而对反应效率造成影响。影响引物和探针的稳定性的主要因素是储存温度、储存时间、是否被长时间曝光、储存的引物和探针的浓度以及储存溶液的组分。
Q：如何长期保持引物和探针的稳定性？
保持引物和探针的稳定性的关键有四点。低压冻干的引物在储存时间和温度方面具有更好的灵活性。引物一旦重新溶解，即应置于 -20 °C 保存，且若保存时间超过一年则应对其进行监测，看它是否出现功能下降。对于标记的引物和探针，则应采取措施避免标记物曝光（例如使用不透明管及置于暗处保存），以延长它们的使用寿命。
引物浓度也可影响其稳定性。建议引物的储存浓度不低于 10 μM；实际上，在大多数情况下，100 μM 的引物浓度操作更简单。引物和探针还应分装保存，以减少冻融次数，特别是标记的引物和探针。最后，TE 缓冲液可形成比水更为稳定的环境。此外，含有 0.1 mM EDTA 的 TE 缓冲液（标准 TE 中含有 1 mM EDTA）是一种理想的溶液，这是由于一些 PCR 反应对 EDTA 的灵敏度可能有一些残存。
NTC 扩增
当引物二聚体形成时，如果使用与 DNA 双链结合的染料，在 NTC 反应中也可观察到荧光信号。也存在另一种情况，在存在污染物的情况下，无论是基于探针还是双链 DNA 结合染料的反应，引物二聚体的扩增也会在 NTC 孔中被观察到。这可能是一种随机事件，并不是所有 NTC 都会出现扩增，通常是由不常见的加样错误引起。如果在每一个 NTC 反应里都出现扩增，很可能是其中一种或两种试剂被污染了。
Q：如何防止或去除污染？
- 使用干净的工作台，用带核酸降解试剂的的溶液擦抹工作台面。
- 用带 dUTP 和 UDG 的反应预混液降解来自前序 PCR 反应的产物，防止前序 PCR 反应的污染。
- 用新的反应管尽量通过置换不同来源的试剂，发现出现问题的试剂。
- 在条件允许的情况下，在不同的实验地点建立反应，尤其是当应用质粒作为对照时（质粒可以被很容易扩散并且难以去掉）。
实时荧光定量 PCR 分析优化过程确实需要时间，但是所花的时间是值得的。这样得出的分析结果不仅具有最高的灵敏度和最大的动态范围，而且准确度高、效率高、重复性好，为实验提供可靠的数据。
