DNA的甲基化一般是抑制DNA表达的，即基因的甲基化水平越高，表达水平则越低，精子和大多数体细胞都符合这种模式。然而在卵细胞基因组中，许多转录惰性区呈现低甲基化特征。这种独特的甲基化模式是怎么形成的，对早期胚胎的发育潜能有什么影响还不清楚。

2018年11月28日中国科学院生物物理研究所的朱冰研究员团队在Nature杂志上发表了名为Stella safeguards the oocyte methylome by preventing de novo methylation mediated by DNMT1的研究成果，发现Stella通过引导UHRF1出核，抑制UHRF1和DNMT1介导的卵细胞基因组甲基化；敲除Stella则会引起卵细胞基因组高甲基化，进而影响合子基因组激活和胚胎植入前的发育。

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背景介绍

DNA甲基化

DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶（DNA methyltransferases, DNMTs）作用下，DNA胞嘧啶（C）的第5位碳原子获得一个甲基，转变为5-甲基胞嘧啶（5-mC）。DNMTs主要分为两类，即维持性DNA甲基转移酶和从头甲基化酶，前者主要指DNMT1，使DNA在复制过程中能将母链的甲基化模式稳定遗传给子链，后者包括DNMT3A、DNMT3B和DNMT3L，能将未甲基化或低甲基化的区域甲基化。DNMT3L自身并没有DNA甲基转移酶活性，主要是增强DNMT3A和DNMT3B的酶活性。

Stella

Stella又名Dppa3（developmental pluripotency-associated 3）或PGC7（primordial germ cell 7），主要表达于原始生殖细胞（primordial germ cell, PGC）、植入前胚胎和其他多能干细胞，在早期胚胎发育和多能性维持中有重要作用。Stella对雌性的生殖能力很重要，既往研究显示，Stella缺陷的雌性小鼠受精后产生的胚胎多停滞在植入前阶段，很少能达到囊胚期。Stella还能够抑制Tet3介导的DNA去甲基化，从而维持母源基因组的甲基化状态。

Uhrf1

Uhrf1（ubiquitin like with PHD and ring finger domains 1）一个多功能的表观遗传调控因子，参与调控DNA甲基化和多种组蛋白翻译后修饰。DNMT1是一种自我抑制性甲基转移酶，受UHRF1调控。UHRF1能够特异性地识别和结合半甲基化的DNA链，并招募DNMT1至DNA链，解除DNMT1的自我抑制性，对新生子链进行甲基化。

合子基因组激活

哺乳动物生殖细胞在减数分裂过程中和受精后形成的早期胚胎中，其基因组是转录静止的，直到受精卵分裂几次后，其基因组才开始转录，表达新的基因，这一事件叫做合子基因组激活（zygotic genome activation, ZGA）。ZGA之前，胚胎的发育主要由母源因子调控。

方法与结果

1 Stella通过出核信号引导Uhrf1出核

作者在体细胞中过表达Stella，发现能引起DNA去甲基化，同时发现Stella与Uhrf1存在相互作用。考虑到Stella和Uhrf1在卵细胞发生过程中都高表达，作者就想在小鼠卵细胞中探究一下Stella是否调控Uhrf1。

在D5~D15的正常对照卵细胞中（Stella+/-，因为卵细胞是单倍体，所以半合子就是正常状态），Stella均匀分布，Uhrf1主要分布于细胞质中，而敲除Stella后，Uhrf1主要分布于细胞核，直到D20才出现在细胞质中，但细胞核中一直存在。在HEK293细胞中过表达Stella，能使UHRF1主要分布于细胞质。

以上说明Stella能够引导Uhrf1出核，那么Stella是如何引导Uhrf1出核的呢？

作者用输出蛋白特异性的抑制剂LMB（leptomycin B）处理过表达Stella的HEK293细胞，能够阻止Stella引导的Uhrf1出核，使Uhrf1主要分布于细胞核。过表达出核信号序列突变的Stella（Stella(NESmut)）同样不能引导Uhrf1出核，尽管Stella(NESmut)与Uhrf1仍存在相互作用。由此说明Stella主要通过出核信号引导Uhrf1出核。

此外，作者过表达一种与Uhrf1亲和力减退但出核信号正常的Stella(KRR)突变体(K85E/R86E/R87E)，可引导部分Uhrf1出核，细胞核内仍有Uhrf1残留，提示Stella引导Uhrf1出核需要Stella与Uhrf1相互作用。

此图为原文Fig. 1。图a-b分别显示正常对照Stella+/−和敲除Stella（Stella−/−）的卵细胞中，卵子发育过程中Stella和UHRF1的细胞定位变化，c图是a-b图的定量。图d显示在稳转GFP-UHRF1的HEK293细胞中慢病毒转染不同形式的Stella或输出蛋白抑制剂LMB，对UHRF1亚细胞定位的影响。

2 Stella通过Uhrf1阻止卵巢基因组过度甲基化

第一部分证明了Stella能够引导Uhrf1出核，那么出核的意义是什么呢？

考虑到Uhrf1参与调控DNA甲基化，作者对不同阶段的卵细胞进行甲基化检测，发现Stella−/− MⅡ卵细胞的总体甲基化水平增加了2倍。异常高甲基化区域主要位于各种类型的重复序列和发育相关基因，印记基因的甲基化水平未发生明显变化。

选择一些独特的100bp片段，若其在D5卵细胞的甲基化水平<25%，而在MⅡ卵细胞的甲基化水平>75%，则定义为卵子发生获得的甲基化区域（oogenesis-acquired methylated regions, ooAMRs）。在正常对照卵细胞中，这些ooAMRs称为normal ooAMRs，有28661个。敲除Stella后，这些normal ooAMRs大多（96.5%）能正常建立，除此之外，作者还发现了28122个extra ooAMRs。

在Uhrf1和Stella双敲除的卵细胞中，那些extra ooAMRs完全消失，其甲基化谱与Uhrf1单敲除的MⅡ卵细胞相似，提示Stella−/− MⅡ卵细胞的异常高甲基化是由Uhrf1介导的。

那么Stella−/− MⅡ卵细胞的异常高甲基化对卵细胞的基因转录和胚胎发育有没有影响呢？

Stella−/− MⅡ卵细胞的异常高甲基化对基因组转录只产生轻度影响，大多数启动子区或CpG岛（CpG islands, CGIs）异常高甲基化的基因在对照组卵细胞中已处于沉默状态，而Stella−/− MⅡ卵细胞的异常高甲基化偏好发生于失活基因的启动子区和CGIs。

作者构建了Stella和Uhrf1分别单敲或双敲的卵细胞，观察其受精后胚胎发育情况（Fig. 2d），发现Stella单敲除的胚胎发育到囊胚期的比例最低，其次是Stella和Uhrf1双敲除。

此图为原文Fig. 2。图a显示敲除Stella或Stella和Uhrf1双敲除对不同阶段的卵细胞总体甲基化的影响，图b显示的是对CpG岛甲基化的影响。图c显示的是Stella和Uhrf1分别单敲除或双敲除normal ooAMRs和extra ooAMRs的变化热图。图d显示的是Stella和Uhrf1分别单敲除或双敲除对胚胎发育的影响。图e显示的是的Stella−/−卵细胞相对于对照的启动子甲基化水平与平均基因表达水平的散点图。

3 Stella缺陷对受精卵和胚胎发育的影响

Stella−/− MⅡ卵细胞的异常高甲基化对卵细胞基因表达只有轻度影响，那它对受精卵的基因转录，尤其是合子基因组激活有无影响呢？

我们知道，受精卵发育初期会发生大规模甲基化擦除，去除双亲的甲基化记忆，然后重新建立甲基化，于是作者首先探究了Stella−/− MⅡ卵细胞的异常高甲基化能否在这一轮甲基化擦除活动中幸免。

作者比较了Stella+/+和Stella△m/+受精卵雌原核的normal ooAMRs和extra ooAMRs的相对去甲基化水平（relative demethylation level, RDL）,发现normal ooAMRs的RDL无明显差异，而extra ooAMRs有相当一部分没有去甲基化（Fig. 3a）。作者同时观察了Stella+/+和Stella△m/+受精卵雄原核的总体RDL水平，发现Stella△m/+受精卵雄原核的RDL水平降低，推测是由雌原核的高甲基化竞争去甲基化酶所致，UHPLC–MS/MS检测发现雄原核5hmC水平降低证明了这一推测。UHPLC–MS/MS同时检测了受精卵总体的5mC和5hmC水平，发现Stella△m/+受精卵总体的5mC和5hmC水平增加（Fig. 3c）。

作者接下来检测了Stella−/− MⅡ卵细胞从MⅡ阶段到受精形成的雌原核和两细胞胚胎阶段，normal ooAMRs和extra ooAMRs的CG甲基化变化，发现这一过程中Stella−/−卵细胞的normal ooAMRs甲基化无明显变化，extra ooAMRs的甲基化水平明显升高（Fig. 3d）。

对两细胞胚胎进行RNA-seq，发现Stella△m/+两细胞胚胎的基因表达明显下调。作者着重观察了合子基因组激活（ZGA）基因，即只有12个ZGA基因能正常激活，167个ZGA基因表达下调（Fig. 3e），且ZGA缺陷基因的甲基化水平明显升高（Fig. 3f）。

为了确定Stella−/− MⅡ卵细胞对基因表达和胚胎发育的影响是由细胞核还是细胞质所致，作者进行了纺锤体移植实验（Fig. 3g），发现细胞核、细胞质同时敲除对ZGA基因表达和胚胎发育的影响最大，其次是细胞质敲除，再次是细胞核敲除（Fig. 3h-i），但细胞核敲除的ZGA缺陷基因甲基化程度高于细胞质敲除（原文Extended Fig. 7d）。

此图为原文Fig. 3。图a是受精卵雌原核normal ooAMRs和extra ooAMRs的RDL变化，RDL>0即说明有发生去甲基化。图b是受精后11-12h收集的雌、雄原核和受精后28h收集的两细胞胚胎的甲基化水平。图c是UHPLC–MS/MS检测受精后14h的受精卵（去除了极体）的5mC和5hmC水平。图d是卵细胞从MⅡ到受精和两细胞（2C）胚胎阶段，normal ooAMRs和extra ooAMRs的CG甲基化变化。图e是Stella△m/+和正常对照两细胞胚胎的基因表达变化，红色代表上调2倍的ZGA基因，绿色代表下调2倍的ZGA基因。图f分析ZGA缺陷基因、ZGA正常基因和其它ZGA基因的启动子区甲基化水平。图g是纺锤体移植图解。图h分析纺锤体移植后受精的两细胞胚胎ZGA缺陷基因的表达。图i显示纺锤体移植后受精的胚胎发育情况。

4 Stella敲除后的异常甲基化依赖DNMT1

背景介绍中提到甲基化转移酶主要有3种，那么Stella−/− MⅡ卵细胞的异常甲基化是哪一个酶催化的呢？

作者用免疫荧光检测了正常对照和Stella−/−卵细胞中DNMT1、DNMT3A、DNMT3B的表达，发现在对照和Stella−/−卵细胞中DNMT3B根本检测不出来，DNMT3As亚细胞定位无明显变化，DNMT1在对照卵细胞中主要定位于细胞质，而敲除Stella后，DNMT1在中心体周围有点状分布（Fig. 4a-b），Uhrf1在此位置也有分布，而敲除Uhrf1后，DNMT1不再在中心体周围分布（Fig. 4c），提示DNMT1在中心体周围的分布呈Uhrf1依赖性。同时作者观察到敲除Stella后，卵子发育过程中主要卫星重复序列的甲基化水平明显增加（Fig. 4d）。

为了明确DNMT1和DNMT3A中究竟是哪一个负责Stella−/−卵细胞的异常甲基化，作者分别构建了Dnmt1和Dnmt3a敲除的卵细胞，进行甲基化检测，发现敲除Dnmt1能明显降低Stella−/−卵细胞的甲基化水平，而敲除Dnmt3a对其无明显影响（Fig. 4e），说明Stella−/−卵细胞的异常甲基化主要依赖于DNMT1。

此图为原文Fig. 4。图a-b分别显示Stella+/−和Stella−/−卵细胞UHRF1和DNMT1的亚细胞定位。图c的DKO指的是double knock out，即Stella和Uhrf1同时敲除。图d显示敲除Stella后卵子发育过程中主要卫星重复序列的甲基化变化。图e显示相应基因型甲基化水平的聚类分析。

结论

敲除Stella能使卵细胞的UHRF1和DNMT1异常聚积于核内，对卵细胞基因组进行重新甲基化，影响合子基因组激活和胚胎植入前的发育。卵细胞正常表达的Stella能够通过出核信号引导UHRF1出核，避免UHRF1和DNMT1对卵细胞基因组进行过度甲基化。

学霸笔记

套路分析

这篇文章作者观察到敲除Stella能使卵细胞的UHRF1发生异位，然后探究此现象的意义。因为UHRF1能够调控DNA的甲基化，作者便从DNA的甲基化着手，发现敲除Stella能引起卵细胞基因组的异常甲基化，并且此异常甲基化依赖于UHRF1。DNA甲基化可以影响DNA表达水平，所以作者同时检测了它对卵细胞基因组表达的影响。

高甲基化的卵细胞受精后会不会对受精卵和胚胎发育产生影响呢？于是作者检测了Stella−/−卵细胞对受精卵甲基化擦除、合子基因组激活和胚胎发育的影响，并通过纺锤体移植实验进一步明确到底是细胞核还是细胞质缺陷造成的这些影响。

Stella−/−卵细胞基因组的异常甲基化是哪一个甲基转移酶催化的呢？作者通过分别敲除Dnmt1和Dnmt3a，明确了Stella−/−卵细胞基因组的异常甲基化由Dnmt1催化，并依赖于UHRF1。

闪光点与不足

这篇文章的闪光点我觉得主要在于两方面，一是揭示了卵细胞基因组低甲基化的原因，二是发现维持性甲基转移酶DNMT1也有重新甲基化的作用。

不足之处，原文讨论中也有提及，就是DNMT1的重新甲基化作用究竟是对DNMT3A催化的半甲基化的CpG岛进行甲基化还是完全自己重新甲基化，文章没有明确证明，虽然作者根据已有证据倾向于后者。

对学霸的启发

这篇文章用的是反证法，通过把Stella敲除出现的一系列异常，证明Stella的作用，感觉挺绕的，学霸看的很痛苦，一开始根本看不懂（充分说明了功力不够），不过看懂之后的成就感也是大大的。

暂时还没想到如何跟自己的课题结合起来，不过倒是提醒自己，不要拘泥于已有的概念，如本文正因为突破了DNMT1维持性甲基转移酶的传统观点，所以才更显突出吧。

希望本文能给你以启发。