一、目的
拷贝数变异（CNV）是人类DNA遗传变异的重要来源，多重连接依赖性探针扩增(MLPA)技术是广泛应用的分子生物学技术，可对人类遗传疾病研究中的多种DNA序列进行拷贝数检，是一种半定量技术。MRc-Holland开发了大量商业化的人类遗传疾病和癌症研究的MLPA检测产品。有关产品本身的详细信息、MLPA实验方案、以及推荐的MLPA数据分析软件coffalyser.net，参见mlpa.com网址。
MLPA®技术的应用
检测基因拷贝数:基因拷贝数是指个体基因型中某一特定基因的拷贝数。MLPA技术可以在一次反应中建立多达40个核酸序列的拷贝数。拷贝数的更改是基因编码的蛋白质表达增加或减少的主要原因。MLPA General Protocol (One-Tube)
用于基因组缺失、复制和点突变的定量检测：在探针完全匹配的连接的情况下，MLPA可识别只有一个核苷酸差异的序列，可以用来检测已知的突变。只有完全匹配的探针才能结扎。
DNA甲基化分析和mRNA分析：已知CpG岛的异常甲基化与人类癌症中肿瘤抑制基因的转录失活有关。 MLPA®允许在单个反应中检测多达40个序列的甲基化状态。MS-MLPA General Protocol (One-Tube)
二、MLPA分析原理
该技术基于探针寡核苷酸的连接和PCR扩增，涵盖了多达60对可对目标基因座进行杂交的多重探针寡核苷酸(每个探针检测长度约为60nt)。每对寡核苷酸适用于特定长度(64-500nt)的扩增产物；并且通过序列标记末端，所有连接的探针可以在PCR反应中用单个引物对扩增。正向PCR引物携带荧光标记，可在自动毛细管电泳(ce)系统上按照探针的分子大小进行检测和定量。该方法已成功应用于外显子缺失和重复引起的疾病研究中,如杜氏肌营养不良症(DMD)和BRCA1/BRCA2基因分析。此外，MLPA技术的升级也可用于各种基因组序列的定量甲基化分析。
MLPA是一种相对的技术:只有通过比较DNA样品的MLPA峰型才能检测出相对的差异。因此，在同一运行中必须包含参考样本。每个探针峰的相对高度，与各种参考DNA样品的相对探针峰高度相比，反映了样品中相应目标序列的相对拷贝数。因此，一个或多个靶序列峰高的相对降低反应了缺失，而相对峰高的增加反映了重复。
三、关键词
MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification)：多重连接依赖性探针扩增。
四、实验
本实验流程仅涉及拷贝数变异的检测流程，不含甲基化检测流程。
MLPA General Protocol (One-Tube)
1、试剂
2、仪器耗材
a、Ultrapure water
b、Calibrated thermocycler withheated lid (99-105°C) and standard laboratory equipment
c、0.2 ml PCR tubes, strips or plates
d、Capillary Electrophoresisequipment
e、Coffalyser.Net analysissoftware
3、样本
a、待测样本
b、对照样本 MRC-Holland阳性对照样品
c、无模板质控
4、实验步骤
4.1 变性/杂交：左和右探针寡核苷酸与其靶DNA结合
4.1.1 变性
a、标记0.2毫升的PCR管或8连管或96孔板，向每个管或孔中加入5μlDNA样品（50-250ng;最佳50-100ng）。使用TE进行无DNA质控；
b、将PCR管或8连管或96孔板放入热循环仪中，启动MLPA热循环仪程序，将样品DNA在98°C下变性5分钟，然后冷却至25°C保存。
4.1.2 杂交
a、准备杂交主混合物，对于每个反应mix：1.5μlMLPA缓冲液（黄色帽）+1.5μl探针混合物（黑色帽）通过吹打或涡旋将杂交主混合物充分混合。
b、向每个变性产物中加入3μl杂交主混合物。通过上下吹打充分混合。
c、运行热循环仪程序：95°C下孵育1分钟，然后在60°C下孵育16-20小时。孵育结束后将样本在热循环仪上45°C保持。
4.2 连接：通过连接酶连接杂交的探针寡核苷酸
a、准备Ligase-65 master mix.。对于每个反应mix：25μl超纯水+3μl连接酶缓冲液A（透明盖）+3μl连接酶缓冲液B（白色盖）+1μlLigase-65酶（绿帽），吹打混匀。注：Ligase-65酶在手中持续10秒温热以降低粘度。不要震荡漩涡连接酶；
b、向热循环仪上的样本中加入32μl Ligase-65 master mix，轻轻地上下吹打混合。
c、继续热循环程序：54℃下温育15分钟（用于连接），98℃下5分钟（用于连接酶-65酶的热灭活），20°C保存。
4.3 扩增：使用荧光PCR引物扩增连接的探针
a、准备Polymerase master mix，。对于每个反应mix：7.5μl超纯水+2μlSALSA PCR引物混合物（棕色盖子）+ 0.5μl SALSA聚合酶（橙色盖子）吹打混匀，不要震荡漩涡聚合酶。
b、在室温下，向每个MLPA反应中加入10μl Polymerase master mix。轻轻上下吸放混匀。
c、运行热循环仪程序：35个循环，95°C 30秒； 60°C 30秒;；72°C 60秒。72℃温育20分钟，15°C暂停。
注：PCR产物可以在4℃下保存1周。长时间储存应在-25°C / -15°C之间。由于荧光染料是光敏感的，因此将PCR产品存放在暗箱中或用铝箔包裹。
4.4 片段分离：毛细管电泳
4.4.1 试剂
a 、High quality formamide (e.g. Hi-Di Formamide, Applied Biosystems)
b 、Labelled size standard：
● Beckman: CEQ™ DNA Size Standard Kit – 600；
● Applied Biosystems: GeneScan™ 500 LIZ®/ROX™ (preferred; mandatory for use with IVD-registered probemixes), GeneScan 600 LIZ®, GeneScan 500 TAMRA™
c 、Polymers：
● Beckman: GenomeLab™ Linear Polyacrylamide (LPA) denaturing gel；
● Applied Biosystems: POP-4 or POP-7 are preferred\POP-6 is not recommended because of its high resolution\SeqStudio POP-1 is integrated in the cartridge.
4.4.2 实验步骤
4.4.2.1 根据实验室仪器按如下列表准备上样混合物（注：实际应根据MLPA 试剂及样本进入量等进行优化）
注意事项：
a 、Size standard、run conditions、polymer、fluorescent dye以及volume of MLPA PCR reaction 依据毛细管电泳设备类型设置。
b 、应定期更换capillaries和polymer，长时间暴露于> 25°C后，polymer会迅速变质。如size standard重复出现低而宽的峰，则capillaries 和 polymer可能已变质。
c、 应使用高品质的甲酰胺（-20℃的等分储存），甲酰胺可以变酸性。加热时可能导致DNA的脱嘌呤和片段化。
d 、不要使用过高浓度的MLPA PCR产物上样，过高浓度的MLPA PCR产物会增加混合物中的盐浓度，和DNA发生竞争，导致MLPA峰偏低。为增加峰高时，应增加注射时间和电压。
4.4.2.2 以ABI3500为例设置上样参数
a、启动系统： 打开仪器电源，仪器自检成功（指示灯变成绿色）； 打开电脑，待电脑右下方处 3500 Server Monitor 完全启动；打开 3500 Data Collection 软件； 输入用户名密码，登陆。
b、进入仪器主界面。创建新反应板—点击“Create NewPlate”。
c、输入反应板基本信息，点击“AssignPlateContents”进入下一界面。
● Name（反应板名称）：如 20190102-MLPA
● PlateType（反应板类型）： Fragment
● CapillaryLength（毛细管长度）：50 cm
● Polymer（胶类型）：POP7
d 、反应板编辑。
● 在反应板界面相应孔位输入标本名称。
● 分配反应板内容：从下方Barcode 框中的 add from library 分别选择相应的 “Assays（运行程序）”“File Name Conventions（文件命名规则）”“Results Groups（数据保存规则及位置）”
首次运行时，先创建反应板内容，并保存到 Library 中，以便后续运行使用
◈Assays 设置
● 首次实验，点击“Create New Assay”创建新反应程序。
● “Assay Name”栏输入程序名称，比如“MLPA”。
● “Instrument Protocols”设置仪器运行条件。
→ 点击右侧“Create New”，进入设置界面。
→ 根据实际使用的 marker 选择荧光组合“Dye Set”，比如使用 LIZ 标记的 marker，一般选择“G5”，使ROX 标记的 marker 则一般选择“D”。
→ RunModule 选择对应的运行模块，3500 一般选择“FragmentAnalysis 50_POP7”。
→ “Protocol Name”属于程序名称，比如“MLPA”。
→ 下方主要运行条件如下：Run Voltage: 15kv，RunTime:1800s，InjectionVoltage：1.6kv，Injection Time：15s。其他默认即可。
→ 设置完毕后，点击 Saveto Library 及 Apply to Assay。
● “Sizecalling Protocol”选择长度读取方法。
→ 一般选择“Fragment_Analysis_PA_Protocol”。设置完毕后，点击 Saveto Library及 Apply to Assay。
◈ FileNameConventions 设置。
用于实验产生数据的文件名设置，可直接选择已有命名规则，或者设置新命名规则。如针对 MLPA设置命名规则，Name 输入规则名称,如 MLPA，下方将需要显示的内容添加到右侧即可。设置完毕后，点击 Saveto Library 及 Applyto Assay。
◈ Results Groups 设置
可选择已有规则，也可选择新建保存规则及位置。如针对MLPA 设置，Name 输入 MLPA；下方可根据实际需要选择文件夹组织方式；可自定义文件保存位置：Select Folder Option 栏 Customfilelocation 右 侧 Browse 选择需要保存的位置；设置完毕后，点击 Saveto Library 及 Apply to Assay。
e、点击选中反应孔位，勾选下方 Assays，File NameConvention 及 Results Group。点击 LinkPlateforRun。
f、关联对应反应板 Plate A 或 Plate B。点击Start Run 开始运行。
4.5 分析报告：Coffalyser Net软件执行质量控制并计算探针比率
a、MLPA数据归一化1：从峰值到剂量商 (DQ)
● 样品内归一化（样品中探针峰的比较）：将每个样本中的探针峰与参考探针峰进行比较，参考探针峰预期应有正常的拷贝数。
● 样品间归一化（比较样品之间的相对探针峰）：待测样本与参考样本峰值比较，参考样本预期具有正常的拷贝数。
b、MLPA数据归一化2：从剂量商到拷贝数
5 MLPA质量控制和故障排除
5.1 MLPA内部质量控制
a、 MLPA内部质量控制片段必须进行检查，以确保满足最低质量要求。只有满足质量要求的数据才适合MLPA结果的计算。如有需要，重复毛细管电泳或MLPA反应。MLPA质量控制片段和MLPA故障排除向导电子学习模块可在www.mlpa.com在线获得。
b、 几乎所有SALSA MLPA probemixes都包含9个质控片段，如下所述：
5.2 无模板质控
在典型的无模板对照中，只有四个Q-fragments可见。然而，在无模板对照中，MLPA PCR反应比正常PCR反应更容易出现非特异性峰。在一些probe mixes中，在无模板控制中可以看到一些峰，这些非特异性的峰不应该影响MLPA结果。如若无模板控制控制中的非特异性峰可重复性地高于Q-fragments中位高度的50%，则通知MRC-Holland。无模板质控
5.2 蒸发
a 、蒸发发生在连接反应或杂交过夜步骤，为减少蒸发应：
b 、使用多通道移液器减少处理时间；
c 、使用8µl H2O 60℃孵育过夜以测试耗材质量及PCR仪的加热盖正常工作，应有大于5µl 的H2O保留；
d 、使用矿物油 (Vapor-lock, Qiagen 981611)：添加少量的油，刚好盖住液面，在加入连接酶混合物步骤：轻轻地在油层下方上下移液。
6 结果可靠性条件
6.1 当下列条件满足时MLPA的结果最可靠
a 、参考样品：所有探针的标准偏差低（<10％），DQ在0.8-1.2之间；
b、 测试样品：参比探针的标准偏差低（<10％），DQ在0.8-1.2之间；
c 、探针显示相邻外显子的信号减少或增加（多外显子缺失或重复）。
d、 使用较少的DNA（如果可能）或使用不同的参考样品在新的MLPA运行中获得相同的结果。当使用较少的DNA时，可能影响探针信号的任何可能的杂质被稀释。
6.2 当下列条件满足时MLPA的结果不可靠
a 、非相邻外显子的探针显示信号减少或增加，例如 外显子3和17缺失。
b 、在同一样品中，一个或多个参考探针显示异常拷贝数。
c 、对于某种疾病，在患者群体中以异常高的频率检测到拷贝数变化。
6.3 获得良好MLPA结果的7大关键要点
a 、在每个MLPA实验中包括至少3个不同的参考样品。
b 、使用与测试样品相同的方法提取的参考样品。
c 、使用Coffalyser.Net进行数据分析。
d 、检查D-control fragments在88nt和96nt确定样本变性是否完全。
e、 样品DNA洗脱和稀释溶液应含有5-10mM Tris-HCl pH 8-8.5。在5分钟DNA变性加热步骤中，水中的DNA样本发生脱嘌呤而损坏。
f 、准确移取3μl杂交主混合物对于获得可靠结果绝对必不可少。
g 、不要使用旧的毛细管或凝胶进行电泳。
7 引起假阳性和假阴性的因素
7.1 检测局限性
a 、导致遗传缺陷的主要原因是小的(如点)突变，其中大多数不会被MLPA probemixes检测到。
b 、MLPA无法检测目标序列之外的任何更改，也无法检测拷贝数中的倒置或易位。
c 、SNP，点突变，小的插入或缺失可阻止探针寡核苷酸的连接或导致探针结合不稳致使探针信号降低。
7.2 样本质量
a 、样品的EDTA浓度不应高于1.5mM。 样品DNA不应通过蒸发或SpeedVac浓缩，因为这会导致非常高的EDTA浓度。
b 、RNAse处理仅在检查样本中高表达的基因时才是必需的。如血液衍生样品中的HBA，HBB基因;（线粒体）核糖体RNA基因（所有组织）。
c 、样本在98℃变性时发生脱嘌呤作用。当样品没有足够的缓冲能力(样品溶解在H2O而不是TE中)时，就会发生脱嘌呤作用，DNA制剂应包含5-10mm Tris缓冲液，pH值为8.0-8.5。如不知道是否存在足够的缓冲液，则应加入Tris-HCl：4μl样品DNA +1μl 50mMTris-HCl pH 8.5。在某些情况下，SALSA样品稳定液(RUO) (S4: SMR04, SMR45)可以改善MLPA反应的质量。如何防止样品脱嘌呤？
d、 样品DNA变性问题导致DNA模板不能用于MLPA探针杂交。例如：某些DNA纯化方法：Qiagen EZ1导致DNA样品中的盐浓度高。当存在超过40mM NaCl或KCl时，富含高GC的区域在98℃下不会变性。
e 、检测或参考DNA样品中的杂质，包括NaCl或KCl (> 40mm)及其他盐类、苯酚、乙醇、肝素、EDTA (>1.5 mM)和铁。
f 、肝素可影响MLPA反应，肝素保存的血液提取的DNA样本应经过Nucleospin gDNA Clean-up XS纯化才可使用。
g 、与简单的单重PCR反应，MLPA对杂质更敏感。DNA提取后留下的污染物可能会影响MLPA的性能。为尽量减少污染物或其他变数的影响，请确保提取方法、组织类型、DNA浓度和处理方法在测试和参考样本中尽可能相似。MRC-Holland推荐下列抽提方法：
Qiagen Autopure LS (automated) and QIAamp DNA mini/midi/maxi kit (manual)
Promega Wizard Genomic DNA Purification Kit (manual)
Salting out (manual)
7.3 实验操作
a 、使用不正确的DNA进入量。50-100ng，5ul体系为最佳推荐上样量，除非探针中特意说明。如需要，可使用乙醇沉淀法浓缩DNA 样本。
b 、使用不合适的参考样本。每次MLPA运行至少使用3个不同的参考样本。当测试>21个样本时，每增加7个测试样本就增加1个参考样本。参考样本应随机分布于整个实验中，以尽量减少变异。
c 、如对样本质量有疑问，应使用一个或多个商业DNA样本进行比较。推荐Promega Cat公司Nr G1471男&G1521女性DNA。商业DNA只能作为检测样品质量的对照品。
d、 建议在每次MLPA运行中都包含No DNA控制。用TE0.1 (10 mM Tris-HCl pH 8.0 + 0.1 mM EDTA)代替5ul DNA，检查TE、MLPA试剂、电泳试剂或毛细管是否受到污染.
e、 使用细胞系DNA时，请注意细胞系可能获得了额外的拷贝数变化，包括完整染色体的得失。www.mlpa.com上提供一份商业上可用的阳性样本清单。
f 、混合酶Mix不当，混合不充分或过于剧烈。
g、 过夜杂交过程中样本的蒸发导致盐浓度过高和DNA二级结构增强，阻止了探针和靶序列的结合。
h 、MLPA反应或电泳过程中其他PCR产物的污染。
i、 毛细管电泳故障导致峰至过高或过低。
j 、数据分析中应使用最新版的Coffalyser.Net软件，使用其他软件可能导致错误的结果。
k 、对已发现的遗传异常的临床效果缺乏足够的认识。并非所有MLPA检测到的缺失和重复都是致病的。
l 、单个探针检测到的重复需要独立的技术确认。
m 、全基因组扩增反应(WGA)由于其扩增偏倚，不适合MLPA。
