前言

我还未想到这个专题叫什么......

暂定“XXX就那样”？

6.GTEx数据库是什么？

首页：https://gtexportal.org/home/

“人类GWAS-转录组-疾病表型补完计划”，噢不，基因型-组织表达计划（Genotype-Tissue Expression project），就是干了这个事。

是的，还真的已经做出来了！10年前的2010年起，GTEx研究联盟的研究收集并研究了来自449名生前健康的人类捐献者的7000多份尸检样本，涵盖44个组织（42种不同的组织类型），包括31个实体器官组织、10个脑分区、全血、两个来自捐献者血液和皮肤的细胞系，作者利用这些样本研究基因表达在不同组织和个体中有何差异。

是的！你没有看错，根据上一话第五点，为了实现这个目的，是需要同时进行了转录组测序和基因分型分析的，才能构建了这个组织特异性的基因表达和调控的数据库。

就是一个这样“泯灭人性”的项目，我说的不是伦理，是资金！即使是现在，一个WES测序都要2-3千人仔！这玩意不要说在5年前的2015，就算是现在，都不是一个随随便便的课题组的经费能够支持的！这是接受美国国家卫生研究院（NIH）资助的，是一个国家级的项目！目的就是要绘制出记录人DNA中影响基因表达的序列片段的详细图谱！

7.GTEx数据库中转录组测序和基因分型都用了什么仪器？

生信常用软件而已，没啥，可以直接跳过。但是知道这些，就就知道了有哪些“类似的”数据可以合并（拿来发文章啊，不要告诉我你看这个不是为了搞科研，发文章，迎娶白富美，走上人生巅峰！～）。

7.1 对于RNA seq

通过illumina Truseq试剂盒构建polyA+文库，采用Hiseq 2000/2500进行测序，对于下机数据，采用STAR进行比对，参照选择的是gencode V19版本的gtf文件，进行了以下3个level的定量

7.1.1 gene-level, 采用RNAseQC软件，对基因的raw count和TPM两种方式进行定量

7.1.2 exon-level, 对exon的raw count进行定量

7.1.3 transcript-level，采用RSEM进行转录本水平的定量

测序平台：Expression Data

- Illumina TrueSeq RNA sequencing

- Affymetrix Human Gene 1.1 ST Expression Array (V3; 837 samples)

7.2 基因分型 genotype

通过WGS对样本进行分型, 采用的是GATK germline variants calling的流程，步骤如下

bwa-mem alignment；picard markduplicate；BQSR；indel realign；haplotypeCaller

测序平台： Genotype Data

- Whole genome sequencing (HiSeq X; first batch on HiSeq 2000)

- Whole exome sequencing (Agilent or ICE target capture, HiSeq 2000)

- Illumina OMNI 5M Array or 2.5M SNP Array

- Illumina Human Exome SNP Array

7.3. eQTL

通过FastQTL软件进行cis-eQTL分析，将基因型和基因表达量进行关联。

8.cis-eQTL分析？什么是cis？能吃的吗？

我们首先需要搞清楚，什么是cis（adj. 同侧的，顺式的）？

看到这里，我们知道了染色体上一些能特定调控mRNA和蛋白质表达水平的区域（一堆SNPs），其mRNA/蛋白质的表达水平量与数量性状成比例关系。

为什么gene表达水平（转录组水平上的），与DNA水平上的snp有关呢？

因为：gene表达水平，与启动子有关。启动子增强，gene 表达水平升高。如果snp位于启动子区域，那么这个snp可能会影响收该启动子调控的gene的表达水平（eQTL关系）。

而这种eQTL关系可分为顺式作用eQTL和反式作用eQTL。

简单来说，就是你（数量性状）要向喜欢的人（基因）表达，要不就是直接和那个人表白（顺式作用，cis），要不就是和其他人搞暧昧，搞到喜欢的人吃醋，向你表白（反式作用，trans），如下：

顺式作用eQTL：

就是某个基因的eQTL定位到该基因所在的基因组区域，表明可能是该基因本身的差别引起的mRNA水平变化；

反式作用eQTL：

是指某个基因的eQTL定位到其他基因组区域，表明其他基因的差别控制该基因mRNA水平的差异。

顺式作用eQTL和反式作用eQTL

然后，eQTL分析都分析些啥？

我们首先复习一下：

“与单个基因mRNA表达量相关的DNA突变，就被称为eQTL”。

什么是相关（显示两个随机变量之间线性关系的强度和方向）？如何定义相关？

当然方法很多，相关性分析，线性回归分析，非线形回归分析等。

他们选择了“线性回归” ，如下：

以全部DNA变异位点（已有：基因分型结果，SNP位点）为自变量（研究者主动操纵，而引起因变量发生变化的因素或条件，被看作是因变量的原因），轮流以每种mRNA表达量（已有：RNA seq结果）为因变量（结果，我们一开始就想知道如何影响基因表达这个结果啊），用大量的个体数据做样本进行线性回归，就可以得到每一个SNP位点和每一个mRNA表达量之间的关系。

多数情况下，我们关心的是“这一个SNP位点在这一个/附近mRNA表达量之间的关系”，所以做的是cis-eQTL分析。

最后，

GTEx项目中采用的是FastQTL软件用于cis-eQTL分析，至于具体原理可以参考在Bioinformatics杂志上发表的文章（https://academic.oup.com/bioinformatics/article/32/10/1479/1742545）。解析这高大上的玩意就完全影响了本文接地气的初衷了。

9.如何阅读eQTL分析？

eQTL的分析结果本质就是一些调控基因表达的SNP位点，箱体图或者小提琴图什么的只是经典的可视化方式而已。

箱体图或者小提琴图eQTL例子

按照SNP分型结果对样本进行分组，用箱体图或者小提琴图的方式展示不同组别中基因表达量的分布，直观的比较不同分组中表达量的差异。如左图表示，有一堆人，分别有69个TT、134个TC和127个GG三个基因型。然后纵坐标是基因表达量（通常是经过各种共变量“调教”后的值），可见，TT中的一群这个基因（RGMB）在食管组织（自己选的组织）中表达“提高”。