这一章主要介绍了ATAC-seq的基本分析方法
ATAC-seq
这种测序主要用于检测全基因组的染色体开放程度的一种方法
它的基本原理是用Tn5 transposase随机插入开放的染色体区域（未开放的区域Tn5插入不进去）
那么PCR扩增出来的是两个Tn5之间的序列，并且但部分片段为100bp
类似于Chip-seq，当我们测序的reads重新mapping到参考基因组以后，开放的区域所测得reads会形成一个peak，那么这个peak所在区域即为染色质开放的区域
所以整个上游分析：
1.mapping：bowtie
2.peak calling：MACS
3.peak annotation
QC
ATACseqQC是针对Paired-End测序开发的
并且对bam文件进行QC
## 加载包
library(ATACseqQC)
## input the bamFile from the ATACseqQC package
#读取file
bamfile <- system.file("extdata", "GL1.bam",
package="ATACseqQC", mustWork=TRUE)
bamfile.labels <- gsub(".bam", "", basename(bamfile))
## generate fragement size distribution
fragSize <- fragSizeDist(bamfile, bamfile.labels)
这幅图主要是看reads的分布
一般read长度集中于100bp左右
那么我们想看染色质开放区域是否在TSS区域，这样TF就可以很轻易的结合上去，从而发生生物学过程
但是Tn5 transposase会带来正链4碱基负链5碱基的adaptor偏移，所以我们要消除这样的误差
#这是bam文件里面的标签
tags <- c("AS", "XN", "XM", "XO", "XG", "NM", "MD", "YS", "YT")
#输出路径
outPath <- "splited"
dir.create(outPath)
#矫正5’末端
library(BSgenome.Hsapiens.UCSC.hg19)
seqlev <- "chr1" ##以chr1为例
which <- as(seqinfo(Hsapiens)[seqlev], "GRanges")
gal <- readBamFile(bamfile, tag=tags, which=which, asMates=TRUE)
gal1 <- shiftGAlignmentsList(gal)
shiftedBamfile <- file.path(outPath, "shifted.bam")
export(gal1, shiftedBamfile)
矫正完成以后，我们可以计算Promoter/Transcript body (PT) score来查看信号是否在promoter区域富集；利用Nucleosome Free Regions (NFR) score来查看TSS附近打开的情况。
library(TxDb.Hsapiens.UCSC.hg19.knownGene)
txs <- transcripts(TxDb.Hsapiens.UCSC.hg19.knownGene)
pt <- PTscore(gal1, txs)
plot(pt$log2meanCoverage, pt$PT_score,
xlab="log2 mean coverage",
ylab="Promoter vs Transcript")
经过比较，我们可以看到在整个基因组上，在TSS附近富集的情况了
同样，我们也可以在基因组范围查看一下整体的开放程度
nfr <- NFRscore(gal1, txs)
plot(nfr$log2meanCoverage, nfr$NFR_score,
xlab="log2 mean coverage",
ylab="Nucleosome Free Regions score",
main="NFRscore for 200bp flanking TSSs",
xlim=c(-10, 0), ylim=c(-5, 5))
查看NFR（Nucleosome Free Regions）上下游分布情况
#分类
txs <- txs[seqnames(txs) %in% "chr1"]
genome <- Hsapiens
## split the reads into NucleosomeFree, mononucleosome,
## dinucleosome and trinucleosome.
objs <- splitGAlignmentsByCut(gal1, txs=txs, genome=genome)
## Save the binned alignments into bam files.
null <- writeListOfGAlignments(objs, outPath)
这里做分类是为了依据片段的大小将reads分类为nucleosome free, mononucleosome, dinucleosome, 和trinucleosome，方便后期查看NFR上下游分布情况以及nucleosome的分布状况
接下来就可以用热图可视化
library(ChIPpeakAnno)
bamfiles <- file.path(outPath,
c("NucleosomeFree.bam",
"mononucleosome.bam",
"dinucleosome.bam",
"trinucleosome.bam"))
##这里是四种类型的nucleosome的bam文件
TSS <- promoters(txs, upstream=0, downstream=1)
TSS <- unique(TSS)
## estimate the library size for normalization
(librarySize <- estLibSize(bamfiles))
## calculate the signals around TSSs.
NTILE <- 101
dws <- ups <- 1010
sigs <- enrichedFragments(gal=objs[c("NucleosomeFree",
"mononucleosome",
"dinucleosome",
"trinucleosome")],
TSS=TSS,
librarySize=librarySize,
seqlev=seqlev,
TSS.filter=0.5,
n.tile = NTILE,
upstream = ups,
downstream = dws)
## log2 transformed signals
sigs.log2 <- lapply(sigs, function(.ele) log2(.ele+1))
#plot heatmap
featureAlignedHeatmap(sigs.log2, reCenterPeaks(TSS, width=ups+dws),
zeroAt=.5, n.tile=NTILE)
接下来我们可以画nucleosome-free and nucleosome-bound regions
#获取nucleosome-free and nucleosome-bound regions的信号
out <- featureAlignedDistribution(sigs, reCenterPeaks(TSS, width=ups+dws), zeroAt=.5, n.tile=NTILE, type="l", ylab="Averaged coverage")
#标准化
range01 <- function(x){(x-min(x))/(max(x)-min(x))}
out <- apply(out, 2, range01)
matplot(out, type="l", xaxt="n",
xlab="Position (bp)",
ylab="Fraction of signal")
axis(1, at=seq(0, 100, by=10)+1,
labels=c("-1K", seq(-800, 800, by=200), "1K"), las=2)
abline(v=seq(0, 100, by=10)+1, lty=2, col="gray")
reCenterPeaks(TSS, width=ups+dws),这幅图说明了在TSS上下1k的局域内peak的情况，是否开放实在TSS上富集，或是其他区域
footprint
footprints可以帮助我们查看转录因子在全基因组上结合的状态。因为transcription factor结合在打NFR区域，所有Tn5 transposase并没有办法在TF结合的区域插入，所以客观上形成一个被保护的区域，一个低coverage区域
library(MotifDb)
CTCF <- query(MotifDb, c("CTCF"))
CTCF <- as.list(CTCF)
print(CTCF[[1]], digits=2)
sigs <- factorFootprints(shiftedBamfile, pfm=CTCF[[1]],
genome=genome,
min.score="90%", seqlev=seqlev,
upstream=100, downstream=100)
结合motif，我们可以看到由于Tn5 transposase没有办法插入到TF结合的位置，相当于该位置是关闭着的 ，所以还可以去做一些motif方面的分析
或用V-plot表示：
vp <- vPlot(shiftedBamfile, pfm=CTCF[[1]],
genome=genome, min.score="90%", seqlev=seqlev,
upstream=200, downstream=200,
ylim=c(30, 250), bandwidth=c(2, 1))
distanceDyad(vp, pch=20, cex=.5)
其中CTCF为CTCF蛋白结合位点
该图中间位置即为结合的蛋白
注释
同Chip-seq
