长链非编码RNA（lncRNAs）在肿瘤发生和免疫应答中起着重要作用。迄今为止，大多数lncRNA研究严重依赖于Bulk RNA测序数据，即各种不同细胞类型的平均信号，这限制了细胞特异性lncRNA功能的发现。尽管缺乏低丰度细胞特异性lncRNA的注释，单细胞RNA测序（scRNA-seq）仍是一个潜在的解决方案。因此，进一步分析lncRNA的不同细胞特征表达和注释在研究lncRNA参与肿瘤免疫微环境中是必要的。

1.总结大量肿瘤研究中与癌症发展、进展和肿瘤抑制有关的功能性lncRNAs的信息。

2.概述当前癌症和免疫相关的lncRNAs在细胞水平上的真实表达以及lncRNAs在TIME中可能具有的细胞功能的知识。

3.讨论单细胞分析在研究TIME lncRNAs的细胞功能方面的前景和挑战。

本文着重对单细胞技术在研究TIME lncRNAs的细胞功能方面进行导读。

TIME lncRNAs的单细胞分析 

单细胞转录组测序允许在单细胞水平上检测新的lncRNAs标记或其功能。Kim等人分析来自体细胞不同重编程阶段的单细胞数据，发现几个lncRNAs集显示重编程过程中表达的动态变化。Bocchi等人从发育中的人类纹状体产生Bulk和单细胞测序数据发现新的lncRNAs调控网络。

当前，有研究使用单细胞分析深入研究了肿瘤细胞和非肿瘤细胞之间的交互。然而，大多数研究都集中在蛋白质编码基因（PCGs）上。只有少数人对lncRNAs进行了分析。Lee等人使用单细胞测序数据观察到lncRNAs在转移性透明细胞肾细胞癌（ccRCC）中的特定作用。作者发现共有173个lncRNAs与ccRCC转移相关，并将它们命名为ccRCC转移相关lncRNAs（CMALs）。基于CMALs和PCGs之间的共表达网络分析，CMALs似乎有助于细胞粘附、免疫反应和细胞增殖，其中12种通过特异性调节TNF和HIF1信号通路来促进癌症转移。尽管全球层面的单细胞lncRNAs研究很少见，但Lnc2Cancer 3.0或LnCeCell等数据库提供了全面的概述，尤其是针对细胞特异性lncRNA相关的ceRNA网络和RNA-RNA相互作用。lncRNA的单细胞研究数量如此有限的原因包括细胞类型特异性lncRNAs的注释不完整以及它们在TIME中的表达相对较低。因此，TIME lncRNAs的综合图谱将是鉴定TIME中功能性lncRNAs的重要资源。

scRNA-seq的一般程序

通过比较bulk和单细胞水平的标记分析可知：bulk RNA-seq主要捕获在大量肿瘤样本中差异表达的lncRNAs标记，而与细胞类型组成无关。scRNA-seq捕获特定于某些细胞类型的lncRNAs标记物以及特定于肿瘤特定细胞类型的标记物。

用于lncRNAs研究的单细胞平台

基于液滴的方法（例如10x或Dropseq）在带有poly-A尾的RNA的3'-末端或在5'-末端产生单细胞读数RNAs，因此需要使用高置信度的基因末端位置来正确量化lncRNAs。由于lncRNAs的丰度低，一些lncRNAs序列仅部分组装，所以目前基因注释中没有全长序列。基于板的方法（例如SMART-seq2）按细胞对全长转录本进行测序。与3'-end scRNA-seq相比，全长scRNA-seq通常从更少的细胞中捕获信息，所以读取覆盖率和每个细胞的基因数量通常远高于3'-end scRNA-seq，可以说全长scRNA-seq为识别TIME中的细胞类型特异性lncRNAs提供了一种更灵敏的方法。

利用公开的肺癌scRNA-seq数据集对两个有代表性的单细胞平台：10x Chromium 3’-seq（10x）和SMARTseq2（SS2）在lncRNAs检测的敏感性方面进行了比较。大约37.6%和65.4%的lncRNAs（以bulk RNA-seq数据表示）也分别在10x和SS2平台中以相似的水平[≥1个转录本（TPM）]检测到。

单细胞RNA-seq数据集中基因的TPM分布，这些基因在每个scRNA-seq平台中的TCGA（肺腺癌和鳞状细胞癌，10X，肺腺癌，SS2）中以≥1 TPM检测到。

在10x和SS2平台中分别可检测到约74.9%和98.2%（≥0.1 TPM）。正如预期的那样，尽管敏感性取决于测序深度，SS2似乎对lncRNAs的检测更敏感。单细胞水平的肿瘤和非肿瘤样本之间的差异表达基因（single cell DEGs）可能与整体水平的差异表达基因（DEGs）不同，主要是因为单细胞DEGs存在于细胞水平。事实上，超过一半的细胞类型特异性肿瘤/非肿瘤标志物（10x为63.64%，SS2为66.67%）仅在scRNA-seq数据中发现，表明对于TIME中的主要和次要细胞类型，scRNA-seq对标志物的检测将更具特异性。

肿瘤和非肿瘤样本中单细胞DEG lncRNAs的比例与来自大量RNA-seq数据或伪大量RNA-seq数据的比例重叠。通过比较来自每种细胞类型的肿瘤和非肿瘤样品的单细胞之间的基因表达，获得单细胞DEGs。通过比较来自成对肿瘤和非肿瘤样本的大量RNA-seq数据之间的基因表达以及分别从来自肿瘤和非肿瘤组织的scRNA-seq数据转换而来的伪大量数据之间的基因表达，获得大量和伪大量DEGs。

Bulk DEGs分析仅概括了15.2%和30.9%的单细胞DEGs，表明SS2对DEGs的检测也更敏感。然而，SS2在反义转录本的准确定量方面存在局限性，因为SS2产生的读数没有链特异性信息。SS2的更新版本SMART seq3现在提供链特异性信息并且可以更准确地量化反义转录本。因此，先前在大量肿瘤样本中研究的许多lncRNAs的细胞类型特异性表达和功能可以使用各种可用的scRNA seq数据集进行验证（见下表）。这一过程可以提供关于TIME特定细胞类型中已知和新的lncRNAs功能和调节作用的新见解。

结论 

lncRNAs通过多种调控机制在癌症和免疫系统中发挥着至关重要的作用。然而，在TIME中lncRNAs的表达和功能表征几乎没有在单细胞水平上进行研究，主要是由于lncRNAs的细胞类型特异性高以及缺乏细胞类型特异性lncRNAs注释。单细胞技术和相关生物信息学工具的更新以及不断改进lncRNAs的细胞类型特异性注释将有助于克服目前对此类RNA进行scRNA-seq分析的局限性。这一成就将开启一个新的篇章，揭示TIME在恶性细胞和浸润性免疫细胞中表达的临床相关lncRNAs，并弥合先前研究的空白。