(一) 什么是双荧光素酶？

答：双荧光素酶通常是指萤火虫荧光素酶和海肾荧光素。其中荧火虫荧光素是从甲虫（Photinus pyralis）中分离得到，分子量为61kDa；而海肾（Renilla）荧光素酶则是从海肾（Renilla reniformis）中分离，分子量为36kDa。这两种酶的区别之一是他们的底物和辅因子不同：萤火虫荧光素酶需要荧光素、氧气、ATP和镁离子同时存在才能发光；而海肾荧光素酶仅需要腔肠素（coelenterazine）和氧气。萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的区别之二是发光的颜色不同：萤火虫荧光素酶产生的光颜色呈现黄绿色，波长550-570nm；而海肾荧光素酶产生蓝光，波长480nm。正是由于这两种酶的底物和发光颜色不同，所以在双报告实验中得到广泛应用，它们的发光原理如下所示：

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(二) 为什么要采用双荧光素酶报告系统？

答：单报告基因实验往往会受到各种实验条件的影响，而双报告基因则通过共转染的“对照”作为内参为试验提供一基准线，从而可以在最大程度上减小细胞活性和转染效率等外在因素对实验的影响，使得数据结果更为可信。

(三) 双荧光素酶在miRNA验证其靶基因方面的原理是什么？

答：双萤光素酶报告基因检测系统在细胞中同时表达萤火虫萤光素酶和海肾萤光素酶，两者没有种源同源性并对应不同的反应底物，故而没有交叉干扰。得益于超强的光信号和超高的信噪比，本系统被广泛用于 miRNA 靶基因验证。 miRNA 主要通过作用于靶基因的 3’UTR 起作用，可以将目的基因 3’UTR 区域构建至载体中报告基因 luciferase 的后面，通过比较过表达或者干扰 miRNA 后，报告基因表达的改变（监测萤光素酶的活性变化）可以定量反映 miRNA 对目的基因的抑制作用，也即用荧光值来判断miRNA是否和靶基因结合。

(四) 在利用双荧光素酶验证miRNA的靶基因方面，插入的3’UTR长度应该是多少？

答：靶基因的3’UTR长度不一，将全长都插入载体中不切实际，通常只插入包括miRNA结合位点前后200bp左右的序列，大概就是400bp[1]，但也有文献插入的是80个bp[2]，有文献选择了200多个bp[3]，但严格来讲，应该选择400bp，以结合位点为中心，上游200bp，下游200bp。

(五) 常用的双荧光素酶载体有哪些？

答：常用的载体有两种策略。第一种是两种荧光素分别位于两个载体上，第二种是两种荧光素酶位于同一个载体上。以第一种为例，这两种载体分别为pMIR-REPORT miRNA载体和pRL-TK载体。经检索发现，pMIR-REPORT miRNA载体是由Ambion开发的载体，它用来克隆插入miRNA靶序列，评估细胞内miRNA功能的载体，该载体的图谱如下所示：

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另外的一个载体是pRL-TK载体，这个载体是由Promega开发的，pRL-TK是海肾荧光素酶报告载体，含有SV40增强子，质粒图谱如下所示：

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从这两个图谱中可以发现，pMIR-REPORT miRNA这个载体主要是用于评估miRNA与靶基因3’UTR的结合，靶基因的3’UTR放在荧光素酶的后面，这个荧光素酶是荧火虫荧光素酶，而pRL-TK这个载体则表达海肾荧光素酶，将这两个质粒共同转染进入293细胞中来检测荧光时，pRL-TK这个质粒起到一个内参的作用。

第二种方案就是将荧火虫荧光素酶与海肾荧光素酶构建到一个载体上，这样偏差更小，毕竟转染一个质粒比转染两个质粒要容易，在这方面，根据检索到的资料显示，现在的这类质比较有名的是Promega公司的pmirGLO质粒，图谱如下所示：

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另外的质粒就是国产的，即复能基因的pEZX-MT06质粒，图谱如下所示：

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(六) 在检测miRNA靶基因时，需要设置多少个分组？

答：首先要知道，插入的靶基因原始3’UTR的质粒叫野生型质粒，除此之外，还需要在萤火虫荧光素酶3’UTR插入miRNA结合位点突变的序列载体，这个质粒通常叫突变型质粒，最后还有各种对照载体，包括萤火虫荧光素酶空载体，miRNA空载体，还有海肾素荧光载体，以文献中的案例[4]说明，此文献使用了6组来进行验证，其分组以及分组说明如下所示：

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注：pGL3是荧光素酶报告质粒，绿色的是对照组，即不加miRNA质粒，红色的是正常组，加miRNA质粒。思路即为荧光素酶质粒（3种情况：①空质粒；②加了WT靶基因3’UTR的质粒；③加了MUT的靶基因3’UTR的质粒）×miRNA precursor（两种情况，即加与不加），经排列组合，即为6组，详细说明如下所示：

第一组 荧光素酶质粒pGL3不加3’UTR片段 + miRNA载体质粒

第二组 荧光素酶质粒pGL3不加3’UTR片段 + miR-200c质粒

第三组 荧光素酶质粒pGL3 -WT-3’UTR+ + miRNA载体质粒

第四组 重点：荧光素酶质粒pGL3 -WT3’UTR + miR-200c质粒

第五组 荧光素酶质粒pGL3 -MUT-3‘UTR+ miRNA载体质粒

第六组 重点：荧光素酶质粒pGL3 -MUT-3‘UTR + miR-200c质粒

理想结果：第四组降低，即miRNA能够与靶基因的3UTR结合，第六组不变，即突变后靶基因3‘UTR不与miRNA结合。

(七) 在检测荧光方面，所使用的仪器是哪些？

答：最经典的仪器就是Promega的GloMax 20/20 发光检测仪，但这种仪器只适合一次检测一个酝酿。但也可以用多功能酶标仪来检测（本实验室的仪器是VARIOSKAN LUX），这种酶标仪可以实现多通量检测。萤火虫荧光素酶产生的光颜色呈现黄绿色，波长550-570nm；而海肾荧光素酶产生蓝光，波长480nm。

(八) 测得结果的数据如何处理？

答：测得的结果一个萤火虫荧光素酶产生的光信号，记为RL1，，海肾荧光素酶产生的信号，记为RL2。RL1/RL2将数据均一化后，每两组之间用ANOVA检测即可。

(九) 参考资料

1. Nicolas, F.E., Experimental Validation of MicroRNA Targets Using a Luciferase Reporter System, in MicroRNAs in Development: Methods and Protocols, T. Dalmay, Editor. 2011, Humana Press: Totowa, NJ. p. 139-152.
2. Zhu, J., et al., TNF-alpha mRNA is negatively regulated by microRNA-181a-5p in maturation of dendritic cells induced by high mobility group box-1 protein. Sci Rep, 2017. 7(1): p. 12239.
3. Zhu, S., et al., MicroRNA-21 targets the tumor suppressor gene tropomyosin 1 (TPM1). J Biol Chem, 2007. 282(19): p. 14328-36.
4. Shimono, Y., et al., Downregulation of miRNA-200c links breast cancer stem cells with normal stem cells. Cell, 2009. 138(3): p. 592-603.