R语言_Affymetrix芯片数据处理
采用数据集GSE66360
##设置工作路径(事先放好原始数据，分组信息，注释文件)
setwd("/Users/apple/Desktop/生信学习材料/生信入门之路/代码数据挖掘/实用数据挖掘/学习记录 /01_差异基因分析/实操模仿66360/")
##安装affy和limma包
if (!requireNamespace("BiocManager", quietly = TRUE))
install.packages("BiocManager")
BiocManager::install(version = "3.12")
BiocManager::install("affy")
BiocManager::install("limma")
BiocManager::install("impute")
install.packages("openxlsx")
install.packages("dplyr")
##加载R包
library("Biobase")
library("affy")
library("limma")
library(openxlsx)
library(futile.logger)
library(dplyr)
##import phenotype data 样本信息读取(手动整理分组信息)
phenoData = read.AnnotatedDataFrame('target.txt')
pheno = pData(phenoData)
View(pheno)
##import Annotaion 注释信息读取（注释探针矩阵）
#仅留下ID列和gene symbol列
anno = read.csv("Annotation.csv",head=T)
View(head(anno))
##Affy包，RMA函数用来标准化。
文章来源：https://mp.weixin.qq.com/s/hvKxGm9nxWr5CThAZ4PK_g
#01_eset.rma = RMA(Data) 设置文件路径，读入原始CEL文件
eset.rma <- justRMA(filenames=paste(rownames(pheno),'.CEL',sep=''), celfile.path='./GSE66360_RAW/')
#获得矫正以后具体的表达值，提取探针水平表达矩阵
datExpr = exprs(eset.rma)
#02_安装impute包计算缺失值（使用KNN法计算缺失值）
#来源生信技能树帖：https://mp.weixin.qq.com/s/6bR21_LvOelwZN5qen_CRw
#impute参数默认的k = 10, 选择K个邻居的值平均或者加权后填充
默认的rowmax = 0.5, 就是说该行的缺失值比例超过50%就使用平均值而不是K个邻居
默认的colmax = 0.8，意思是该列缺失值超过80%就报错
library(impute)
imputed_gene_exp = impute.knn(datExpr,k=10,rowmax = 0.5,
colmax=0.8,maxp =3000, rng.seed=362436069)
datExpr2 = imputed_gene_exp$data
View(datExpr2) #datExpr2为计算缺失值的矩阵
#输出未均值处理的表达矩阵datExpr2，手动添加ID列名
write.table(datExpr2,file="Unproccesed_datExpr2.txt",sep="\t")
#读入手动修改的表达矩阵datExpr3
datExpr3 <- read.csv('./proccesed_datExpr2.csv',header = T)
View(datExpr3)
#将(未处理的表达矩阵datExpr3)和(注释探针矩阵anno)合并为一个矩阵datExpr4
datExpr4 <- merge(anno,datExpr3,by='ID')
View(datExpr4)
#03_多个探针对应一个基因的情况取平均值得到datExpr5表达矩阵
datExpr5 <- aggregate(x = datExpr4[,3:ncol(datExpr4)],
by = list(datExpr4$Gene.Symbol), #根据gene名
FUN = mean) #重复基因表达量取平均值
View(datExpr5)
##04导出最终表达矩阵Final_Expdata
write.table(datExpr5,file="Final_Expdata.txt",sep="\t") #输出txt文件
write.csv(datExpr5, file ="Final_Expdata.csv",sep ="", row.names =TRUE, col.names =TRUE, quote =TRUE) #导出csv文件
#######差异表达分析
#样本分组（样本表达矩阵）
Group = factor(pheno$group,levels=c('MI','control')) #样本进行分组
design = model.matrix(~0+Group) #对样本的实验设计进行计算
colnames(design) <- c('MI','control')
design
###Limma包差异分析三步：
#手动删除datExpr5第一列数字列，得到datExpr6，操作使得基因名作为行名
datExpr6 <- read.csv('./Final_Expdata.csv',header = T)
rownames(datExpr6)=datExpr6[,1] #取出第一列，基因名作为行名，为后续lmfit()函数构建
datExpr6=datExpr6[,-1] #将第一列删除
head(datExpr6)
##01_第一步：线性模型拟合
fit <- lmFit(datExpr6, design) #构建比对模型，比较两个条件下的表达数据。注意基因名作为行名，否则可能会报错。文章来源：https://shengxin.ren/question/1446
contrast.matrix <- makeContrasts(MI-control,levels=design) #正值代表R对比NR高表达,负代表低表达（通常是实验组减对照组）
fit2 <- contrasts.fit(fit, contrast.matrix) #比对模型进行差值计算
##02_第二步：贝叶斯检验
fit2 <- eBayes(fit2)
##03_第三步：找出差异基因检验结果，并且输出符合条件的结果;
#以下选择一种差异基因筛选模式运行即可
##01_All_Degs输出
diff <-topTable(fit2, coef=1, n=Inf) %>% na.omit()
#02_P值和LogFC调整阈值输出
diff = topTable(fit2,adjust.method="fdr",coef=1,p.value=0.05,lfc=log(2,2),number=5000,sort.by = 'logFC')
View(diff)
dim(diff)
#output 输出差异表达基因
write.xlsx(diff,'DEG_MI vs control.xlsx',sheetName=colnames(contrast.matrix)[1],col.names=T,row.names=T,append=T)
记录：2021.4.19
