基因结构注释的方法包括：
- 从头预测根据基因结构的特征，基于算法（大多为隐马尔可夫模型）进行预测
- 蛋白注释根据物种自身（或近源物种）的蛋白序列，进行注释
- EST 注释根据物种自身（或近源物种）的EST/RNA 序列，进行注释
最后对多种方法得到的证据进行整合。基因注释的流程有PASA、Maker、 BRAKER 和Funannotate，其中Maker 和Funannotate 整合度比较高，而Maker 更为成熟。
对于近缘物种有Augustus 参数模型，推荐使用Maker注释；近缘物种无Augustus 参数模型，则先使用BRAKER 训练参数，然后再使用Maker 预测。
使用BRAKER 训练参数模型
使用Maker 流程之前，需要先训练参数，一些常见物种Augustus 软件有训练好的参数，但是大多数动植物是没有合适的物种参数可选的，就需要自行训练。
BRAKER 流程的优点是可以根据RNA-Seq 数据或者蛋白序列与参考基因组的比对情况，完成Augustus参数的训练，训练好的参数可以用于Maker 流程。
构建基因参数模型
输入数据：基因组文件，RNA-Seq数据
# 为hisat2 构建参考序列
hisat2-build genome.fasta genome.fasta 1>hisat2-build.log 2>&1
# 使用 hisat2 进行比对
hisat2 --new-summary -p 8 -x enome.fasta \
-1 1.fastq.gz -2 2.fastq.gz -S rnaseq.sam 2>hisat.log
samtools sort -o rnaseq.bam rnaseq.sam
# 运行 braker
braker.pl --species=species \ 你的物种名
--genome=genome.fasta \
--bam=rnaseq.bam \
--cores=8
- 重要参数
–fungus 基因组为真菌
–softmasking 基因组是 soft masked
–useexisting 不从头训练，而是使用已有的物种参数
--UTR=on 根据 RNA-Seq 比对情况训练UTR参数，必须有 --softmasking 和 --bam
训练好的参数，会自动存放在/augustus_config/species 目录下，可直接使用。
使用Maker 进行基因结构注释
maker 是一个完整的基因结构注释流程，推荐使用。
maker 教程：MAKER Tutorial 2013 - GMOD
数据准备
蛋白和EST 序列可以先从NCBI 来查找，打开Taxonomy Browser1 ,输入物种名称来下载。
EST 序列也可以使用RNA-Seq 拼接得到。
参考脚本
# 配置参数
maker -CTL
生成三个文件：
maker_bopts.ctl 配置软件参数，几乎不需要修改
maker_exe.ctl 配置依赖软件的路径
maker_opts.ctl 配置要进行的分析、使用的数据，最为重要，根据自己的需求要适当修改
maker_opts.ctl的重要参数
#-----Genome (these are always required)
genome=contig.fasta #基因组序列
organism_type=eukaryotic #eukaryotic or prokaryotic. Default is eukaryotic
#-----EST Evidence (for best results provide a file for at least one)
est=est.fasta # EST序列或者拼接的转录本
#-----Protein Homology Evidence (for best results provide a file for at least protein=protein.fasta #蛋白序列
#-----Repeat Masking (leave values blank to skip repeat masking)
model_org=all
repeat_protein=/home/genek/software/Maker/maker-2.31.10//te_proteins.
#-----Gene Prediction
ugustus_species= #使用 augustus --species=help 查看est2genome=1
protein2genome=1
trna=0 #find tRNAs with tRNAscan, 1 = yes, 0 = no snoscan_rrna= #rRNA file to have Snoscan find snoRNAs
#-----External Application Behavior Options
cpus=1 #CPUS 个数，如果使用MPI始终设为1
#-----MAKER Behavior Options
max_dna_len=100000 #切分的长度
min_contig=10000 #小于这个长度的序列跳过
min_protein=50 #最少氨基酸数目
split_hit=10000 #最大 intron
tries=2 #尝试次数
TMP= #自定义临时文件夹
配置完成后，输入maker 即可自动加载配置文件，运行程序
输出结果合并
fasta_merge -d genome.maker.output/genome_master_datastore_index.log -o ge
gff3_merge -d genome.maker.output/genome_master_datastore_index.log -o sesame.all.maker.gff3
