报告基因: 萤火虫荧光素酶
内参基因：海参荧光素酶
应用，我需要用到的两个方面：
1.验证miRNA和mRNA靶向互作，将待测基因的3'UTR序列插入报告基因载体，再共转入该miRNA,检测荧光素酶活性下降，则提示为其靶基因。
2.验证miRNA同lncRNA靶向互作。将待测lncRNA序列插入报告基因载体的3'UTR区域，检测荧光素酶活性。
实验步骤：
1、报告基因质粒的构建。将目的片段插入到荧光素酶表达的报告基因载体上，如pGL3-basic。
2、转染细胞。将报告基因质粒和phRL-TK(内参)共转染细胞，根据需要对细胞进行处理。共转染时，由于内参具有很强的启动子，因此报告基因质粒：内参转染量一般为10:1~50:1。
Luciferase活性测定：
⑴ 初次使用时，配制LAR II，即Firefly luciferase的底物。将LAR II溶解在LAR II buffer中，并分装-80℃避光保存。
⑵ 加入1X PLB，室温裂解细胞15 min。
⑶配制Stop&Glo，即Renilla luciferase的底物，能够终止LAR II的反应。
⑷ 测定荧光值。向40 ul的LAR II中加入10 ul细胞裂解液，吹打混匀后，检测读数，即为Firefly luciferase的值。加入40 ul Stop&Glo，再次读数，即为Renilla luciferase的值。
⑸ 数据处理。首先计算出每管的Firefly luciferase/Renillaluciferase的比值，再以control组的比值为单位1，即可得到不同处理组的相对luciferase活性，也就是该处理组基因转录的调控活性。
作者：生物女学霸
链接：//www.greatytc.com/p/d7f0d0b9564d
来源：简书
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lincRNA与miRNA的靶向互作实例。
需要的质粒：
1.firefly
a.原始质粒
b.插入目的序列质粒
c.插入突变/缺失序列的质粒
2.Renilla
d.renilla 原始质粒
实验注意事项:
主要流程:
1.报告基因质粒构建
2.细胞转染，细胞处理
3.报告基因检测
4.结果计算
基因质粒构建中，分情况而言，启动子研究中构建到fluc上游，而我的lnc研究中是将lnc序列构建在3'UTR序列上。
细胞转染：
1.我这次选择的是瞬时转染，我不需要大批量的实验。
2.转染方法上一般有三种：
磷酸钙沉淀法、阳离子脂质体、阳离子聚合物。
转染效率影响因素：
试剂选择：
数据处理！重要！！
实验具体步骤：
1.铺板
PBS清洗293T细胞2~3次（10cm皿），加入胰酶1ml，37℃消化1min，加入含血清DMEM（百分之5血清）2ml终止消化，吹打下细胞。转移至15ml离心管中，1000RPM离心5min。
2.弃上清，2mlDMEM重悬细胞，铺板（每个样品设置3个复孔）， 培养箱中培养， 待细胞密度70-80%可以转染。
分组设计:
空白组（转染试剂+细胞）
质粒组
质粒+miRNA nc组
质粒+miRNA mimics组
其他准备：（转染试剂的配置）
3.转染（其中要根据转染试剂说明书具体调整，每种品牌的转染试剂要求不一样的）
a 取质粒（两种荧光素酶质粒加上miRNA的模拟物等）和转染试剂分别加入含50ul无血清！！DMEM的EP管中 。 混匀，常温孵育5min。
b 将上诉两种混匀，室温孵育15min。
c 去除孔板中的培养基，加入无血清DMEM吼，加入上一步制备的转染复合物，混匀（根据说明书调整液体）， 37℃培养4-6小时，去除培养基，加入含血清培养基， 37℃培养48h。
双荧光素酶检测
1.裂解细胞（需要购买裂解液PLB，使用前放至常温）
24孔板中每孔加入细胞裂解液体200ul。 冰上裂解10min（注意无酶操作）。
- 收集裂解液，离心，取上清，加入96孔板，每孔25ul/10ul。（每组重复5次，我看视频是这样子的）
3.配置海参荧光素酶工作液体
4.萤火虫荧光素酶检测
开启化学发光仪，在96孔板中每孔加入100ul萤火虫素酶检测工作液混匀，上机测发光值（测量时间0.1s）。(此步需要闭光)
检测后
5.海肾荧光检测
每孔加入海参荧光工作液100ul ，混匀，（设置发光波长后，测量时间0.1s）。
后续就是实验分析。
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