第二章 癌症中DNA甲基化及其他表观标志物
——感谢毕老师的无私翻译奉献
2.1 引言
与致病或治疗干预的药理学反应相比，生物标志物需要更客观地测量和评估。具体地说，生物标志物就是指示相关的分子（可以是DNA，RNA或蛋白靶标）的表达或状态的变化，与疾病的风险（检测）或进展，或疾病治疗预后的效果。
生物标志物可以根据其性质以定性或定量方式进行分析，但测量必须客观，以排除观察个体差异的错误。生物标志物可以是生理测量值（例如，血压），但是现在通常是组织或体液的分子测量。尽管蛋白质标记物是最常研究的，但为了突破某些应用领域的限制，许多基于RNA或DNA的生物标记物（或DNA修饰，例如表观遗传改变）已在过去十年中被发现，目前正在人群样本中进行测试[1]。
本章讨论癌症的遗传与表观遗传起源，包括癌症易感性，以及表观遗传生物标志物如何用于临床实践。
2.1.1 诊断标志物
对于诊断或筛查，生物标志物是识别具有疾病或恶化前病症（例如，胃肠癌或前体病变）个体的有效工具。在胃肠道肿瘤中，诊断主要基于内镜手术;然而，依赖于分子标记的基于血液或粪便的方法的生物标记物可以有助于优化该诊断手段或替代用于食道癌，胃癌或结肠癌的第一种基于群体的筛选方法的内窥镜程序。虽然这些测试可包括DNA（如用于结肠直肠癌检测的粪便测试）或基于蛋白质的标记物（如用于鉴定血液中的平均血浆葡萄糖浓度的糖基化血红蛋白），但迄今为止，大多数生物标记物在临床治疗上的效果并不明显。目前还没有开发出基于血检的胃癌或食管癌诊断方法，尽管存在基于血检结肠癌检测，但它们在临床研究中还不规范或不标准[1]。
2.1.2 疾病进程标志物
除了内窥镜监测和活组织检查之外，还可以使用进展或监测标记物来预测癌症的风险。DNA甲基化和异常生物标志物在癌症中具有显著癌前病变，例如化生或腺瘤，被认为是更具侵略性的癌前病变（如食道中的高度异型增生，或结肠中的绒毛息肉）。这些标志物可能包括突变和表观突变，以及组织活检和血液或粪便的测试中的蛋白质表达[1]。
2.1.3 预测标志物
通过响应预测标记分析某些治疗手段对特定患者的潜在影响，包括影响化疗药物代谢的基因中的突变或特异性DNA甲基化，例如替莫唑胺的MGMT甲基化，或使用西妥昔单抗或HER2的KRAS突变过度简化曲妥珠单抗的适应症。生物标志物的预测也可以应用在治疗后的复发或复发中，因此将影响严苛的监测策略（will influence stricter surveillance strategies）。值得注意的是，虽然大多数应用提到与疾病相关的诊断和预后生物标志物，但预测标志物是药物相关的生物标志物，其目的是表明药物是否对特定患者有效。到目前为止，这些标记可能是在临床常规中可实施的唯一标志物[1]。
2.1.4 新型生物标志物的发现
我们通常使用两种方法来发现新的生物标志物：
假设驱动鉴定（hypothesis-driven identification），主要是通过使用在癌发生过程中重要分子的生物学关键参与者[2]；
系统学方法（systematic approach），通常采用全基因组筛选技术进行靶标识别。
举例说明，如是卵巢癌中的IFFO1 [3]，结肠直肠癌中的SEPT9 [4]和Barrett食管中的TFF3 标志物[5]。 这种方法偏差较小，但可能导致较高的假阳性率和较低的重复率，并可能导致产生标记物组（或基因特征）（marker panels (or gene signatures)）。验证阶段对于独立研究中可重复的结果至关重要;这似乎是一个重要问题，因为目前很少有生物标志物可以研究到临床阶段[1]。
2.2 癌症的发生
一般来说，癌症被视为由一系列突变导致异常的细胞增殖引起的疾病。突变通常影响癌基因或肿瘤抑制基因，从而引起肿瘤发生。基因组的不稳定性可以促进突变积累[6]。癌症发病机制的早期假设认为，肿瘤抑制基因的失活总是需要两次命中（突变），第一次发生在体细胞或种系中（即遗传），而第二个发生在生长阶段的体细胞中[7]。
绝大多数常见癌症发生概率较低。在患有此类疾病的患者中，多种常见等位基因可能会增加癌症风险，每种等位基因只有极小的的影响[8]。 在10%-30％的家族性癌症中，人群中风险等位基因的频率从低到高不等，对癌症风险的影响从弱到中等。 不到5％的癌症代表单基因中具有高致病性突变的单基因疾病；在正常人群中几乎没有相同的变化。提出了更多关于导致癌发生的特定机制，详见第7章。
2.3 癌症的表观突变研究
表观遗传学近年来已成为一个新研究的领域。生活方式，压力，药物，病理生理情况和药理学干预通过改变甲基化组，microRNA表达和共价组蛋白修饰对细胞的表观遗传密码有很大影响[9]。 人类基因组计划[10]极大地促进了对人类疾病（包括癌症）背后的遗传因素的理解。 目前，大约100个基因（相当于人类基因组中所有基因的0.5％）显示出高度或中度的突变，这些突变是遗传性癌症的基础[11]。 包括主要的DNA错配修复（MMR）基因MLH1和MSH2基础Lynch综合征，APC（腺瘤性息肉病）基因潜在家族性腺瘤性息肉病，以及BRCA1和BRCA2基因潜在的遗传性乳腺癌和卵巢癌综合征。 此外，利用新技术（如NGS测序）可以对整个癌症基因组进行系统筛查，目前已发现约400种在癌症中发生突变的，可能引起癌症的基因[12]。
癌基因的激活和肿瘤抑制基因的失活以及基因组不稳定性也可以通过表观遗传机制实现。与基因突变不同，表观突变不会改变DNA的一级序列，并且是可逆的。与遗传突变相似，表观突变与基因表达的特定模式相关，这些模式可通过细胞分裂遗传[6]。
2.3.1 食管腺癌
食管腺癌起源于称为Barrett食管（BE）的癌前病变，被认为是对胃食管反流病的适应症。像许多侵略性癌症一样，存活率非常低。因此，目前迫切需要生物标志物作为预后标志物，来鉴定由内镜诊断和组织学证实的Barrett食管患者，发生食管腺癌的风险是否增加[1]。 有人提出AKAP12的高甲基化[13]可能是有用的筛选标记，因为甲基化发生在metaplasia-dysplaia-carcinoma的早期，其早期检测增加了患者的生存率。早期检测食管癌的其他标志物有Reprimo（RPRM）[14]和TAC1 [15]的高甲基化。 关于Barrett食管向食道癌的进展，目前学者已经鉴定了几种DNA甲基化标记物。 例如，一项研究表明，非发育异常的Barrett食管或低度不典型增生患者的CDKN2A，RUNX3和HPP1的高甲基化与恶性转化为高度异型增生和食管癌的风险增加相关[16]。另一项研究表明，APC，TIMP3和TERT在患者中甲基化程度明显高。APC和CDKN2A的高甲基化也与发展为高度异型增生或食管癌的风险的增加有关[18]，甲基化生物标志物组包含8个基因（p16，RUNX3，HPP1，NELL1，TAC1，SST，AKAP12，和CDH13），可以预测50％的重症患者[19]。
除了疾病发展标志物之外，预后生物标志物可用于确定哪些患者可以从侵袭性治疗中受益，因为存活率的测量通常是临床治疗最后一步。超过50％的EAC患者的肿瘤基因谱易发生APC，E-钙粘蛋白，MGMT，ER，CDKN2A，DAPK，TIMP3的甲基化，其存活率较低，也易发生肿瘤早期复发[20]。与存活率降低相关的其他甲基化基因包括APC [21]，NELL1 [22]，以及无细胞血清中DAPK和APC启动子的甲基化[23]。 预测治疗非常重要，以便为每位患者提供最佳治疗方案并避免无效治疗。 因此，当涉及化学疗法时，响应预测标记在临床实践中非常重要。9个基因的甲基化组（CDKN2A，RPRM，p57，p73，RUNX3，CHFR，MGMT，TIMP3和HPP1）在无治疗应答者中显示出比在治疗应答者中更高数量的甲基化基因[24]。DAPK启动子甲基化也与新型辅助放化疗有关[25]。
2.3.2 胃癌
胃癌在全球癌症病例中约占总数的8％，占所有癌症死亡病例的10％以上。 幽门螺杆菌感染被认为是大多数胃癌的诱因。一些表观遗传修饰变化常出现在胃癌患者中，如启动子区域中CpG岛的异常甲基化，可被认为是诊断胃癌的合理标志物。目前已经有学者在胃癌患者的血浆和粪便样品中检测到RPRM甲基化，该基因可能是一种潜在的诊断标志物[26]。CDKN2A [27]和RASSF1A [28]也被认为是胃癌的诊断标志物，其中一些标志物甚至可以作为血清或血浆标志物，但缺乏大样本量的验证研究。异常甲基化组，例如CDH1，CDKN2A，RARB [29,30]，或CDH1，GSTP 1，hMLH1，MGMT，CDKN2A，CDKN2B，SOCS1，TIMP3，TGFBR2 [31]，或RUNX3，CDKN2A，CDH1和RASSF1A [32]，也经过验证，被认为在癌症患者中检出率高达55％。 通常检测到的表观遗传变化，如启动子区域CpG岛的异常甲基化，可能被认为是胃癌的另一种分子表型[33]。 甲基化hMLH1启动子区域的CpG岛是胃癌中一个常见事件，与MLH1表达缺失有关。因此，大多数胃癌表现出微卫星不稳定性，因此我们可以将胃癌患者基因组的不稳定性与表观遗传改变进行关联研究[34]。 肿瘤中，多个基因座中的并发高甲基化现象被定义为CpG岛甲基化表型（CIMP），可能与胃癌中微卫星不稳定性[35]和DNMT1高表达[36]有关。有文献已经提到RUNX3的甲基化可作为胃癌的潜在诊断标志物[3739]，同时也是预后不良的标志物[40]，其与基因组不稳定[41]以及幽门螺杆菌感染[42]有关，在血清中也有检测到[43]。 目前，还没有针对胃癌的诊断标志物的测试。一些基因，如CDKN2A，RARB和CDH1不仅可以提供诊断信息，还可以提供胃癌预后信息[44]。 DAPK，PYACRD和BNIP3的高甲基化也被指出不仅是预后而且是预测性的化疗标记[45]，DAPK与白细胞介素6在血清中的水平有关，而白介素6正是癌症发生，进展和转移的重要细胞因子[46]。 目前针对胃癌患者预后和生存的生物标志物已经进行了大量研究。甲基化DKK3 [47]，TFPI2 [48]和PAX6 [49]是最有希望作为预后生物标志物的候选物。
2.3.3 结直肠癌
结直肠癌为癌症的遗传和表观遗传研究提供了一个有用的模型，因为它是通过良性前驱病变和息肉从正常粘膜发展而来。Knudson的双击理论[7]假设了显性遗传的癌症与其散发的癌症之间存在机制联系。在遗传形式中，肿瘤抑制基因中的一个突变（第一次命中）是遗传的，第二次命中发生在（并且限于）靶组织中的体细胞癌祖细胞中。在散发形式中，在肿瘤发生之前，两个非活性的突变（two inactivating hits）中，每个等位基因中有一个在体内发生。积累证据表明，无论是命中还是两者，都可能是遗传或表观遗传的作用。此外，尽管肿瘤抑制基因通常在细胞水平上是隐性的，但存在例外，包括显性负效应（其中突变体）基因产物拮抗野生型产物），单倍体不足（其中单个等位基因的失活足以引发肿瘤发生），或突变等位基因的残余功能（其中可能需要两次以上的命中以启动肿瘤发生）。在这种情况下，基因剂量的细微变化可能会引发细胞向癌症的发展，表观遗传机制可能起到特殊的作用[6]。
SEPT9是一种参与胞质分裂和细胞周期调控的基因，被认为是结直肠癌的潜在生物标志物[4]：与健康对照组相比，结直肠癌患者呈现出SEPT9启动子的异常甲基化[50]。 尽管这些标志物已在市场上出现，但它们的特异性也受到了质疑[51]。
2.3.4 林奇综合症
Lynch综合征是一种多器官癌症综合征，是程序性表观突变（constitutional epimutation）的例子。这个概念指的是给定（非印迹）一个等位基因启动子的高甲基化，导致所有主要体细胞中等位基因的表达沉默。If a separate inductor (e.g., an adjacent genetic alteration) for the epigenetic change exists, epimutation can be classified as secondary or primary [52]。Lynch综合征与种系中的种系突变有关[53]，即MLH1或MSH2 [55,56]的表观突变[54]，在次级表观突变中，转录的缺乏终止密码子的基因（例如，PTPRJ中列出的基因）表2.1）读入相邻的，结构正常的基因（MSH2和PTPRJ）诱导后者的基因发生启动子高甲基化[56,57]。 在另一个例子中，热冲击因子（heat shock factor）与MLH1的5’UTR中SNV结合可能与MLH1的表观遗传变化有关[58]。该理论可以解释约10％的林奇综合征病因，且MLH1或MSH2蛋白的家族在肿瘤组织中不存在并且各自没有遗传突变基因在种系中是可检测得到[59,60]。 初步观察其他一些基因（如KLLN [61,62]）被认为是癌症易感性的主要机制。癌症易感性的表观突变的实例在表2.1中。
2.3.5 子宫内膜癌和卵巢癌
子宫内膜癌是最常见的妇科恶性肿瘤。APC启动子的高甲基化区域是子宫内膜肿瘤发生的早期事件[65]。子宫内膜癌中CDKNA2启动子区域的高甲基化可能是高增殖和高侵略性肿瘤的诱因[74]。与MLH1和MGMT的灭活一致，它是原发性子宫内膜癌和卵巢癌发生的早期事件[75]。 检测MGMT高甲基化可能有助于诊断对烷化化疗具有特异敏感性的妇科恶性肿瘤。MLH1突变或表观突变也与SESN3和TITF1的异常甲基化密切相关 [81]。CDH13，GSTP1和RASSF1 的甲基化变化检测可早于基于传统基因组学的检测[67]。此外，通过结缔组织生长因子（CTGF）启动子的高甲基化导致的表观遗传沉默导致CTGF的丧失功能，可能是卵巢癌发展的一个因素[76]。卵巢癌也与高甲基化细胞有关分化基因有关，特别是HOXA10和HOXA1 [79]。
2.3.6 肺癌
肺癌是世界上最致命的癌症之一，发病率和死亡率最高。虽然肺癌的预后效果差，5年生存率仅为15％，但有证据表明，早期诊断可以降低肺癌死亡率。许多技术帮助发现了多种肺癌的生物标志物，特别是近年来随着NGS测序技术的出现，以及支气管镜和成像技术的进步[84]，包括APC，TMS1，RASSF1，CDKN2A，DAPK的异常甲基化[85,86]。最近，在全基因组甲基化分析中，将肺肿瘤组织与正常肺组织进行比较时，发现同源框2（SHOX2）在肺癌中高度甲基化[83,87]。
2.3.7 胶质母细胞瘤
DNA修复蛋白O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（MGMT）从DNA中去除O6-烷基-鸟嘌呤，由烷化诱变剂诱导的DNA损伤。2000年，据报道，MGMT甲基化可预测用烷化剂卡莫司汀治疗的胶质瘤患者的结果。 MGMT启动子的甲基化与肿瘤治愈，无病生存期延长，均可归因于甲基化的MGMT沉默，引起的癌细胞对卡莫司汀的敏感性的增加[80]。
2.3.8 造血系统癌症
研究DNA甲基化的高通量测序技术促进了多项研究成果，重点是淋巴系统恶性肿瘤的分子分型。一项早期研究明确基于甲基化模式可分离小B细胞淋巴瘤亚型[88]。 此外，还鉴定了候选基因，并进一步研究了解滤泡性淋巴瘤，套细胞淋巴瘤和慢性淋巴细胞白血病（LRP1B，ARF4，POUF3，HOXC10，LHX2，MLLT2）的发病机制[64]。学者还确定淋巴瘤的不同亚型具有不同程度的DNA甲基化变化。例如，观察到套细胞淋巴瘤和慢性淋巴细胞白血病（均为非生发中心肿瘤）比滤泡性淋巴瘤（生发中心淋巴瘤）具有更少的甲基化基因。另一项研究旨在确定惰性与快速进展的慢性淋巴细胞白血病是否可根据DNA甲基化模式进行分离[64]。
DNA甲基化和复杂的人类疾病使用新一代测序技术，目前对25个可能在淋巴恶性肿瘤的发展中起作用的候选基因的甲基化情况进行了研究[89]，尤其是DLC-1和LRP1B启动子的甲基化[77,89]。 这些研究表明，除了能够基于DNA甲基化的差异模式分离淋巴恶性肿瘤之外，在淋巴瘤的亚型中特定CpG基因座的甲基化也存在定量差异。 大弥漫性B细胞淋巴瘤的分子亚型之间存在不同的甲基化模式[90]。
这些结果提出了关于生发中心反应及其在DNA甲基化中的作用的问题。 异常甲基化的基因可以作为早期的生物标志物诊断淋巴瘤，评估淋巴瘤的进展，并作为淋巴瘤患者的预后指标。Irving及其同事使用了一组三个基因（CD38，HOXA4和BTG4）并创建了一个联合甲基化评分，该评分结合了每个基因的甲基化状态，以预测淋巴细胞白血病的结果[70]。 每个基因都显示出与患者结果的相关性，而且当所有三个基因一起使用时，相关性变得更强。该研究还利用甲基化CpG岛扩增和微阵列杂交技术鉴定了慢性淋巴细胞白血病异常甲基化的280个靶点[69]。 在这280个异常甲基化基因中，发现两个基因（LINE1，APP）的甲基化状态与总体较短的存活率相关。该筛选鉴定了252个潜在的甲基化基因。 然后，研究人员通过检查38个原发性套细胞淋巴瘤样本中的25个候选基因，确定了一组五个基因，其甲基化程度与套细胞淋巴瘤（SOX9，HOXA9，AHR，NR2F2和ROBO1）的侵袭性临床特征相关。
甲基化生物标志物与侵袭性疾病之间的关联也已在弥漫性大B细胞淋巴瘤中显示。 CDKN2A，VHL，DAPK和SHP1的高甲基化与弥漫性大B细胞淋巴瘤中的侵袭性表型相关[68]。 另一项研究发现，MGMT和P57KIP2启动子中的甲基化可用于预测用环磷酰胺，羟基柔红霉素，长春新碱和泼尼松为基础的化疗治疗的弥漫性大B细胞淋巴瘤患者的生存率[73]。 重要的是，甲基化生物标志物的效用独立于观察到的甲基化的功能相关性。因此，即使所涉及的基因/基因座当前没有已知的功能相关性，也可以开发有助于预测患者病程的panel。
DNA甲基化和复杂的人类疾病已经在淋巴系统恶性肿瘤中报道与诱导性Wnt信号传导项管，并且多项研究表明该途径中的基因异常甲基化[64,82]。 正常的Wnt / B-连环蛋白通路是很好理解的，主要是控制增殖和分化。为了使这条途径具有活性，Wnt基因必须与受体结合，导致B-连环蛋白破坏复合物失活，并使B-连环蛋白转移到核，它调节Wnt靶基因的转录。 许多基因包含Wnt途径，并且它们通常可以分为Wnt信号传导的正调节剂或负调节剂。 负调节因子通常在淋巴恶性肿瘤中下调，而正调节因子通常上调。迄今为止，已经鉴定出许多在淋巴瘤中异常甲基化的Wnt拮抗剂（如WIF1，DKK3，APC，SFRP，SOX9，SOX11）[64,78,82]。 鉴定这些基因很重要，因为它可以更好地理解导致淋巴瘤中异常Wnt信号传导的机制。 例如，在通路中，这些“制动器”的失活，可能有助于允许激活其他通路。由于该途径中的许多基因可能具有激活该途径的相同作用，因此我们考虑下游Wnt靶标基因激活的功能性后果是很重要的。例如，已经显示超过50％的慢性淋巴细胞白血病患者在七种Wnt拮抗剂基因中的至少一种中具有异常甲基化[78]。
2.4 结论
为了进行预后评估，我们需要能够指示结果好坏的标志物（如特定时段内存活的可能性）。除了肿瘤大小，预后评估包括分子和组织学标志物，因为具有较差预后的更具侵袭性的癌症类型具有不同的遗传和表观遗传变异。生物标志物可以帮助决定治疗方案，并评估疗效[1]。在开始任何治疗之前，我们需要更多的前瞻性研究，以便对疗效进行正确的评估。目前看来，分子标志物将在未来帮助我们实现个性化的，靶向个体治疗。
作者：Michel Neidhart （University Hospital Zurich, Switzerland）
翻译：毕老师
编辑：浩渺予怀
年代：2015
语言：英语
版权：Copyright © 2015 Elsevier Inc. All rights reserved.
来源：https://doi.org/10.1016/C2013-0-13028-0
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