1. Author
Anne Moscona实验室对引起严重和流行的儿童疾病的副粘病毒以及影响人类的新出现的副粘冠状病毒进行基础研究。研究了常见的儿科呼吸道病毒（副流感病毒、呼吸道合胞病毒）以及新出现的致命亨尼帕病毒（尼帕和亨德拉病毒）。重点是病毒在感染初期进入宿主细胞的机制。实验室以鉴定病毒受体结合蛋白在感染期间激活病毒融合过程中的关键作用而闻名。通过确定融合激活的机制，Anne Moscona现在已经确定了干扰病毒进入过程的有希望的靶点。
2. Background
有包膜病毒已经进化出表面糖蛋白复合物，介导包膜与靶细胞的融合，并将病毒基因组递送到靶细胞的细胞质中。对于包括多种人类病原体的副粘病毒科，该复合物由两种膜蛋白组成，这两种膜蛋白协同介导结合和细胞进入。对于人副流感病毒 3 (HPIV3)，融合/进入装置由受体结合蛋白血凝素神经氨酸酶 (HN) 与融合蛋白 (F) 复合而成。F 在融合前状态下合成为亚稳态前蛋白。HN 在受体结合之前稳定 F 蛋白，以防止病毒失活。一旦与宿主细胞受体结合，HN 就会转变为新的角色：HN 柄与 HN 头部的两个位点进行通信，从而激活三聚融合 (F) 蛋白，诱导 F 发生构象变化，使其插入宿主中细胞膜。 F延伸插入靶细胞膜并重新折叠以介导病毒-细胞融合和病毒进入。
3. Methods
1. 病毒的培育与纯化
2. 化合物与抗体的合成
3. 冷冻电镜解析复合物
4. Results
实验团队直接从人类气道上皮组织培养物中捕获病毒，对真实的 HN/F 复合物进行冷冻 ET 结构研究。 因为是直接在网格上捕获的病毒，无需高速离心或其他破坏性步骤，所以具有完整的脂质双层和复合物。HN二聚体头部在病毒膜表面上方175 Å，并且位于 F 上方。
就HN球状头部结构域相对整个复合体而言，二聚体的一个单体与唾液酸残基结合，另一个与F蛋白相互作用，使F蛋白保持融合前构象。实验采用了两种结构解析方法，分别是冷冻电镜与X射线衍射技术。晶体的结构图相对“紧密”，冷冻电镜结构则松散；实验团队鉴定了HN钟Q559R突变会减少 HN/F 相互作用 ，降低融合激活。HN 中的其他几种二聚体界面突变N551D和H552Q降低HN稳定prefusion能力并增强HN对F的激活。
HN与F的相互作用而言，HN蛋白的386-392位的Loop环与F蛋白188-196位的疏水口袋相互作用，这个结合位点位于F蛋白的顶端（site Ø）。更准确的来说386-392形成了类似thumb样结构，294-300位残基形成finger样结构，可以很好的契合F疏水口袋，进而相互作用。 虽然RBP在各病毒中是不保守的，但是这种thumb-finger的motif是保守的。
后面在抗体压力选择实验中，实验团队鉴定出了2个重要的突变位点：F-A194T位于F蛋白顶端，PIA174的结合位点；HN-H552Q在HN二聚体界面，增强F蛋白的激活。
5. Discussion
作者：Tara C. Marcink
通讯作者：Anne Moscona
单位：Department of Pediatrics, Columbia University Vagelos College ofPhysicians and Surgeons, New York, NY, USA
年份：2023
期刊：SCIENCE ADVANCES
科学问题 ：HPIV感染宿主细胞的机制
结论：目前很少有包膜病毒糖蛋白的高分辨率（<10Å）表面糖蛋白结构被解析，如果没有高分辨率的结构信息，就无法回答有关该复合物机制的关键问题。实验团队设计了方法来研究稳定插入真实感染性病毒粒子表面的病毒包膜中的完整 HPIV3 HN/F 复合物。证明HN以二聚体的形式存在于病毒表面，而不是四聚体。并且HN二聚体中每个原聚体的球状头相对于彼此旋转，因此二聚体的一个HN头 向下指向接触 F，而另一个 HN 头朝上定位在复合物上方，可与目标受体结合。HN 二聚体的一个球状头盖住融合前 F 的顶端，并向下延伸一个环，与 F 内的口袋相互作用。在持续性 HPIV3 感染的患者中出现了该环 (G387S) 的突变，这表明该环的生物学相关性 HN/F 相互作用位点。在 2019 年韩国冠状病毒大流行期间出现的 HPIV3 毒株中，在 HN中发现了环突变，这表明环（thumb）的特性可能赋予一些进化优势。 这种环结构（而非序列）在副粘病毒的 HN/H/G 蛋白中也高度保守。 由此产生的稳定的复合物可能是病毒疫苗的理想抗原。PIA174的结合位点与HN的结合表位重合，所以PIA174能够结合在F的顶端位点 Ø，进而阻止膜融合。在PIA174 的选择压力下，出现了两个特别显着的突变，一个是 HN/F 环界面处的 F (A194T)，另一个是HN (H552Q)。HN 中的 H552Q 突变可能是在抗体选择下出现的，以补偿 F A194T 突变对 F 顶点的 HN/F 相互作用的扰动。由仅携带 A194T 的 F 介导的融合可以被完全抑制。观察到的 HN 球状头的方向表明，在前受体结合复合物中，二聚体中只有一个头可以参与受体结合和唾液酸酶活性，而另一个头则负责稳定 F，即当一个头与受体接合时，另一个头从 F 口袋中释放并经历构象转变。假设原聚体头部在受体结合时旋转，启动信号从一个原聚体转移到另一个原聚体。科学假设为HN 头之间的旋转轴充当“铰链”，允许 HN 原体头相对于彼此旋转，从而在受体结合后通过 F 顶点激活F。HN 头部旋转可以诱导茎螺旋相对于彼此的滑动。受体结合蛋白茎和融合蛋白配对的特异性有助于提供适当的茎高度，以将受体结合蛋白的 F 相互作用环定位在顶端口袋。在我们的病毒进化实验中，在抗F中和抗体PIA174的选择压力下，出现了HN/F界面突变，也观察到了HN茎的突变。尽管这些病毒受体结合蛋白之间完全缺乏序列同源性，但 HN 头部的向下环与 F 顶端之间的相互作用是高度保守的结构。使用冷冻电子断层扫描 (cryo-ET) 获得病毒表面 HPIV3 HN/F 复合物的亚纳米分辨率，这是第一个不对称病毒融合复合物的原位结构，揭示了融合前的 HN/F 相互作用，这对 HPIV3 的机制具有关键意义。HN/F 环袋接口可以提供新的广泛副粘病毒抗病毒靶位点。
