背景：单细胞VDJ的背景、原理等。
1.为什么做单细胞VDJ？
理论上生物体内的基因组DNA是完全相同的，除了肿瘤细胞会发生频繁的DNA突变。因此，常规的单细胞研究不用关心DNA水平的变化，只需要测序转录组（基因表达调控的结果）差异。
大部分细胞的基因组都完全相同，但淋巴细胞除外，淋巴细胞在发育过程中可以重排胚系基因组中的抗原受体基因，从而形成淋巴细胞丰富的抗原受体多样性。
因此，单细胞VDJ测序的细胞对象是：淋巴细胞；
单细胞VDJ测序的目的是：研究抗原受体多样性。
单细胞VDJ能够检测样本中具体某个亚类T/B细胞的TCR/BCR多样性变化，以及某种克隆型在各类T/B细胞中的频率，传统的VDJ只能知道样本中TCR/BCR多样性的总体值（要说传统测序和单细胞的差别，几乎都有：样本vs具体细胞类型的差别）；
举例：单细胞转录组仅仅基于MARKER基因对T细胞进行分类，但对于同一亚类的两个Th细胞来讲，尽管他们的基因表达模式相似，但携带的TCR不同，那么他们在免疫过程中的功能可能完全不同。
对免疫细胞同时开展5`转录组和VDJ测序才能最大程度地揭示T/B细胞的多样性，以及他们在转录调控中的变化。
2.如何从基因片段理解VDJ？
2.1 BCR
BCR分为轻链和重链；
如下图所示：
BCR轻链（light chain）上，V、J基因片段在个体胚系基因组上远离，但在B细胞内经过重排，原来相互远离的V和J基因区段接合产生了连续的外显子，其编码整个轻链V区。在转录后，通过RNA剪切将V区外显子连接到C区外显子上，构成完整的轻链mRNA，进一步可以表达为轻链蛋白；
在重链(heavy chain)上，V、D、J基因在个体胚系基因组上远离，经过重排，D、J连接在一起形成DJ片段，然后一个V基因片段重排至DJ形成一个完整的V区外显子。经过转录后，RNA剪切将V区外显子连接到C区外显子上，形成完整的mRNA，进一步表达为重链蛋白。
2.2 TCR
TCR分为α链和β链；
如下图所示：
类似的原理，T细胞受体α链和β链由V和C区组成，TCR 的α链含有V和J基因片段，β链含有V、D、J基因片段，这些基因片段在原始的胚系基因组上有多个拷贝且彼此远离，通过DNA重组和mRNA剪切VDJ片段被选择和拼接为连续完整的mRNA片段，并翻译为有具体功能的TCR蛋白。
3.如何从功能区理解VDJ？
从功能角度来看，V区片段分为CDR区和FR区。在BCR重链上，CDR3横跨V区D区和J区，在轻链上，CDR3横跨V区和J区；在TCRβ链上，CDR3横跨V区D区和J区，在α链上，则横跨V区和J区。
T/B细胞的发育成熟，除了受机体微环境的影响，还在很大程度上决定于自身携带的抗原受体类型。TCR/BCR克隆型与机体微环境（微环境中的细胞组成、温度、含氧量等）持续互作，共同决定T细胞与B细胞的发育分化。
4.影响抗原多样性的原因是什么？
多样性的来源：
1.重组多样性
2.高拷贝多样性
在最初的胚系基因组中VDJ基因片段有多个拷贝，高拷贝意味着低选择压，这些片段具有极高的突变率和群体多样性。
3.序列随机删除、引入的多样性
4.体细胞超突变的多样性（只发生在B细胞，不发生在T细胞）
5.10x VDJ建库原理是什么？
这两句话的意思是VDJ和5`转录组文库来自于相同细胞的cDNA扩增，也就是说在同一个GEM内做了逆转录和cDNA扩增后，才分为两种文库——exp文库和VDJ文库，因此它们的barcode标签相同，如下图所示：
值得注意的是，VDJ和5`转录组文库来自于相同细胞的cDNA，而蛋白受体文库是来自于相同细胞的DNA。
Amplified full-length cDNA from poly-adenylated mRNA is used to enrich full-length V(D)J segments (10x Barcoded) via PCR amplification with primers specific to either the TCR or BCR constant regions. If both T and B cells are expected to be present in the partitioned cell population, TCR and BCR transcripts can be amplified in separate reactions from the same amplified cDNA material.
请注意，以上10x文库原话说明可以在同一个细胞的扩增cDNA中同时做TCR和BCR。
最终文库如下图所示：
在下机后的VDJ数据处理中，只保留在5`转录组中识别为细胞的barcode，不在的则从VDJ数据中移除，如下图所示：
