反向遗传学是从病毒基因组的全长cDNA拷贝中产生病毒，被称为“感染性克隆”，并且是现代病毒学中最强大的遗传工具之一。 重组DNA技术使我们能够在分子水平上分析和操作基因组。然而，对于非逆转录RNA病毒，基因组在复制过程中不会进入DNA阶段，直接操作脆弱的RNA基因是一项挑战。流感病毒的基因组分段且为负链，所以流感病毒的遗传操作更加苛刻。
为了作为启动转录和复制的功能模板，流感病毒RNA（vRNA）必须通过聚合酶复合物转录为正义mRNA，其中包括三种病毒聚合酶（PB2，PB1和PA） 和核蛋白（NP）。流感病毒具有由8个RNA基因区段组成的基因组，必须对其进行表达和包装以完成病毒复制周期。
流感病毒的反向遗传系统于1999年由两个不同的研究小组建立，依靠细胞内RNA聚合酶I（PolⅠ）合成流感病毒RNA。RNA聚合酶I是一种丰富的核酶，可转录核糖体RNA。RNA聚合酶I在确定的启动子和终止子序列处起始并终止转录，并且所得的转录物在5'或3'末端不含有额外的核苷酸。因此，这种酶非常适合在细胞核中产生流感病毒vRNA。虽然流感病毒拯救系统在不断完善提高，但使用RNA聚合酶I系统合成vRNA的基本概念仍然相同。
目前，流感病毒的重新合成主要通过用8-12个质粒共转染细胞来实现。其中，8质粒系统拯救甲型流感病毒最为广泛。8种质粒含有编码RNA聚合酶I可识别的启动子和终止子，在启动子和终止子之间分别含有每条流感病毒分段基因组的cDNA。8质粒系统的蛋白质由PolⅡ转录翻译，且此系统至少需要表达4种蛋白（PA, PB1, PB2和NP）。一般的8质粒系统可转录流感病毒的8个基因，翻译流感病毒的10个蛋白。翻译完整的流感病毒蛋白，能够提高流感病毒的拯救效率。
protocol：
克隆8质粒：
使用含人类polⅠ序列的载体作为拯救系统的表达载体，构建8质粒拯救系统。此载体为双向双表达载体，在polⅡ启动子(CMV)和终止序列(SV40)之间反向插入了人类polⅠ启动子和鼠polⅠ终止序列。将流感病毒的8个cDNA（包括UTR和ORF）插入该载体，转染细胞后，polⅠ负责合成流感病毒单股负链RNA，polⅡ负责转录流感病毒正链mRNA，随后翻译流感病毒蛋白。该质粒较特殊，在插入片段的前后均有polyA尾，无法用通用引物测序，需要使用每个基因的特异性引物进行测序。
拯救甲型流感病毒：
1. 将HEK-293T接种到6孔板中，培养24小时至少95% confluence。
注：因转染会加入大量的有毒性转染试剂，故细胞状态需要良好、数量需求较多。由于人类polⅠ启动子的物种特异性，只能使用具有高转染效率的灵长类动物来源的细胞（293T或Vero细胞）进行流感病毒的包装。一般来说，293T拯救效果强于Vero。由于MDCK细胞支持许多流感病毒的生长，并且可以在与293T细胞相同的培养基中生长，因此共培养的293T-MDCK细胞（1：1）可用于提高某些流感病毒株的拯救效率。
2. 在DMEM培养基（不含FBS）中，每个质粒1μg，8个质粒共计8μg，与转染试剂混合，室温下静止15-30分钟。
注：质粒：脂质体=1：3；质粒：PEI=1：4。DMEM可换成Opti-MEM。
3. 更换HEK-293T的DMEM培养基（含FBS），将质粒-转染试剂复合体缓缓滴入6孔板中。
4. 将细胞放于含5%二氧化碳的37℃培养箱中培养。
注：35℃环境也可。
5. 转染后24小时，加入终浓度为1μg/ml的TPCK处理过的胰酶，继续培养。
注：TPCK胰酶用于切割流感病毒的HA蛋白，使病毒具有感染性。某些病毒株可不用此胰酶。
6. 转染后48小时或72小时后，收集HEK-293T细胞上清液。此时，流感病毒即在上清液中，但是滴度极低。
注：反复冻融3次细胞有助于细胞内的流感病毒释放。
7. 将收集的上清液滴入MDCK细胞中，流感病毒感染MDCK细胞以扩增。
注：同样需要加入终浓度为1μg/ml的TPCK处理过的胰酶。用鸡胚培养流感病毒效果极佳：接种到9-11天龄的SPF鸡胚胎中。孵育48小时后收获羊膜尿囊液。感染性病毒的存在可通过血凝素（HA）试验确认。
8. 感染后48小时，收集MDCK细胞上清液，进行plaque assay进行病毒滴度的测定。
注：一般测出的滴度处于5x10^6Pfu/ml左右。若想增加流感病毒滴度，继续将病毒感染MDCK以进行扩增。
9. 应通过对8个病毒基因片段中的每一个进行测序来确认拯救病毒的身份。
10. 病毒液可在4℃存放数周。-80℃可长期储存。
参考资料：
