CRISPR/Cas9 系统作为细菌和古细菌的获得性免疫系统， 通过 RNA 介导特异性的切割外源遗传物质， 用以对抗入侵的病毒和质粒。利用 Cas9 来摧毁入侵 DNA 的 Type Ⅱ CRISPR/Cas 系统， 可以在体外进行基因的编辑。
为了提高CRISPR/Cas9 的特异性，使用 Cas9 切口酶和一对 sgRNA，两个相近的切口造成 DNA 双链断裂， 诱导细胞发生非同源末端连接修复， 造成目的基因的突变。
利用 CRISPR/Cas9 进行基因的编辑，首先要构建有效的 sgRNA。一般地，基因特异的 sgRNA 模板序列为位于 PAM 序列（Protospacer Adjacent Motif）前间区序列邻近基序。这是一种见于 crRNA 分子的短核苷酸基序，可以被 Cas9 蛋白特异性识别并切割的 20 个 nt。 而 PAM 序列的特征为 NGG（其中 N 为任意核苷酸）
01
****找敲除目的基因的外显子****
根据目的基因选择待敲除靶基因位点找出敲除目的基因的外显子。 首先在第一个起始密码子 ATG 之后的外显子中找出特异性高的上下游序列。以小鼠基因 Th 为例。在 pubmed 上找到基因的 mRNA 的 CDS 区，选择第二个外显子作为敲除位点。
02
****设计成对 sgRNA 序列****
打开网站 http://crispr.mit.edu，将基因名称，邮箱，第二外显子序列输入到对话框，点击 Agree and submit，等待网站设计成对的 sgRNA 序列。一般推荐网站设计，因为网站可以预测脱靶位点数，避免基因脱靶产生。当然也可以手动选择特异的 sgRNA 序列。
设计成对的 sgRNA 序列。打开 Nickase analysis，如图所示，网站会给出多组成对 sgRNA 序列，如箭头所示，并且预测可能脱靶数。
03
****分析成对 sgRNA 序列****
打开 http://www.oligoevaluator.com，将 sgRNA 输入，点击 Calcute，得到基因分析。综合考虑 Tm（56~62）、GC content （45～60%） 及 secondary structure 来最终确定适宜的 sgRNA 序列，因此，高 score 的序列不一定是最佳序列。
如图，第一对 81 分的序列，Tm 值大于 62 度，而且存在稳定二级结构，所以并不推荐。所以应该从上述成对序列中继续寻找合适成对 sgRNA 序列。
04
****根据找到的合适的 sgRNA 订购 oligo****
图为 U6 真核表达载体设计，Forward oligo:5'-ACGG, Reverse oligo:5'-AAAC。
05
****关于 cas9 的几个注意事项****
CRISPR-cas9 最主要的要求：PAM 序列为 NGG。
sgRNA，即 cas9 guide RNA，是引导 cas9 蛋白在基因编辑位点进行定向切割，所以一般是 20 个碱基，不含 PAM 序列。
设计的 sgRNA 一定有效吗？一般设计好的 sgRNA 会在细胞水平验证下 DNA 水平的编辑效率，通过对细胞 DNA 序列测序以及 T7EN1 酶切验证敲减效率。对于目的基因，更主要的是验证蛋白基因 mRNA 水平进行验证。
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cas9 的相关应用：
（1）敲减细胞，可以选择 lenti-crisprv2 系统，通过包装慢病毒，可对目的细胞进行转染，并不断药筛得到稳定敲减细胞系。
（2）构建基因敲除编辑鼠。根据染色体修复方式又可分为 knockout 与 knockin 两种形式。
