脱靶检测技术助力Cas9研究

该项研究目前主要有3个方向:

首先,是CRISPR Screen文库脱靶检测

1.应用目的:CRISPR Screen检测是基于用文库及选择机制后的细胞系进行二代测序,分析统计每一种sgRNA reads 富集数,并对不同组的sgRNA数目的增多或减少进行统计,获得与选择机制相关的基因。

2.检测的原理:以PCR产物(250-280bp)为模板,DNA模板经过末端修复和加A尾后,在片段两端分别链接接头,中间不进行PCR扩增,制备PCR-free文库,采用PE150测序策略完成测序,运用生物信息学分析方法获得每种sgRNA reads富集数,并进行组建比较分析。

3.应用方向:1)sgRNA文库筛选;2)组间sgRNA差异比较

4.CRISPR Screen 文库检测流程:PCR产物——PCR-free文库——上机测序(illumina)——数据质控——对不同处理组样本进行比对,统计sgRNA变化,绘制热图、箱线图等

其次,全基因组敲除脱靶检测

1.检测的原理:将基因组DNA经Covaris破碎仪随机打碎成长度为350bp左右的片段,经末端修复和加A尾后,再在片段两端分别链接街头,制备DNA文库,并采用PE150测序测略完成全基因组测序,通过BWA、SAMtools等分析软件获得变异信息。

2.研究的目的:可以针对CRISPR/Cas9技术进行基因敲除的样本,全基因组重测序(WGS)技术可以针对全基因组脱靶信息进行扫描,并可以对sgRNA同源序列进行统计,筛选是否在该同源区域发生脱靶,以及得到具体的编辑方式。

3.应用的方向:1)CRISPR/Cas9技术对细胞系进行编辑后,药物筛选出所得表型但靶位点未发生编辑,寻找脱靶位点2)筛选全基因组内是否存在其他脱靶位点。

4.WGS敲除脱靶检测的流程:样本的检测——DNA随机打断(350bp)——加街头——Cluster制备——测序

此外,是全基因组插入脱靶检测

1.研究目的:针对基因插入的样本,WGS技术可以针对全基因组信息进行扫描,查找外源片段的插入位点。

 2.应用方向:寻找插入位点——在基因组中随机插入一段序列,需要明确插入位置的研究。如CRISPR/Cas9敲除技术或转基因插入研究。

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