20200515·Kony
Nuclear Factor Kappa B–Mediated CD47 Up-Regulation Promotes Sorafenib Resistance and Its Blockade Synergizes the Effect of Sorafenib in Hepatocellular Carcinoma in Mice
文献基本信息
影响因子：14.971
PMID：25902734
期刊年卷：Hepatology 2015 Aug;62(2)
DOI：10.1002/hep.27859
作者列表： Lo J, Lau EY, Ching RH, Cheng BY, Ma MK, Ng IO, Lee TK
1.背景知识
- 索拉菲尼是晚期HCC患者的一种新标准治疗方案，但受限于耐药性的产生
- T-ICs：Tumor-initiating cells，肿瘤起始细胞诱导耐药产生
- T-ICs同时具有癌细胞样和干细胞样的特征，包括肿瘤发生、自我更新、分化、耐药性
- T-ICs的marker：CD47 (main)，EpCAM（epithelial cell adhesion molecule ），CD24，CD133
2. 实验内容
2.1 实验目的：探究HCC对索拉菲尼产生耐药性是否由T-ICs导致
2.2 实验内容
- 建立体内/体外索拉菲尼耐药的细胞系；
- 探究索拉菲尼耐药克隆群是否具有T-ICs的特征包括致瘤能力、自我更新能力、侵袭能力，marker
- 寻找CD47上调的上游机制：NFκB作用于CD47启动子的调控元件促进其表达上调，通过正向（刺激NFκB）/反向（抑制NFκB）实验进行验证
- 探究NF-κB在索拉菲尼耐药细胞中的表达情况是否与CD47的表达趋势一致；
- 反向验证CD47上调后导致耐药（腺病毒KD，CD47抗体阻断）
- 体内实验：索拉菲尼联合CD47抗体具有协同抗肿瘤作用
3. Result
3.1 建立体内/体外索拉菲尼耐药的HCC细胞系
- 体外耐药细胞建立：（4个月+）
Huh7：5uM
Bel-7402：10uM
验证耐药细胞是否成功建立
Fig.1A：耐药细胞形态上的变化（纺锤形/圆形）
Fig:1B：耐药细胞对索拉菲尼的敏感性降低（Annexin V染色）
Fig:1C：索拉菲尼对耐药细胞增殖能力的抑制作用降低（XTT实验）
Fig.1D：索拉菲尼诱导耐药细胞凋亡的作用减弱（WB：Bcl2，Bax，PARP） -
体内耐药细胞模型：PDTX#1和PDTX#5移植瘤长到5mm后按100mg/Kg口服索拉菲尼31days
Fig. 1E：索拉菲尼对耐药移植瘤几乎没有表现除抑制作用
Fig.1.png
3.2 索拉菲尼耐药细胞的T-ICs的特征增强，且在这些细胞中CD47的表达上调
验证索拉菲尼耐药细胞是否具有T-ICs的特征
Fig. 2A：体外耐药细胞致瘤能力增强（肿瘤形成实验）
分别连续注射100和500个索拉菲尼耐药的Bel-7402和Huh7足以使NOD/SCID小鼠持续产生肿瘤
Fig.2B：体内耐药细胞的致瘤能力增强
从索拉菲尼耐药的PDTX#5实体瘤分离出单个HCC细胞后再次连续注射到NOD/ SCID小鼠
Fig.2C：体内体外耐药细胞自我更新能力增强（体成球实验）
Fig. 2D：Bel-7402和Huh7的侵袭迁移能力增强（侵袭、迁移实验）
索拉菲尼耐药细胞T-ICs的marker的表达情况
Fig. 2E：体外索拉菲尼耐药细胞T-ICs（CD47, CD24, CD133, EpCAM）的表达上调（qPCR）
Fig. 2F体内体外索拉菲尼耐药细胞T-ICs marker（CD47, CD24, CD133, EpCAM）的表达上调（FCA）
3.3 索拉菲尼耐药HCC细胞中NF-κB处于活化状态
转录水平寻找耐药细胞中CD47上调的机制
Fig. 3A/B：体外耐药细胞的CD47启动子活性较高
寻找调控启动子活性的结合位点
Supporting Fig. 2：UCSC分析发现，CD47启动子起始位点有两个NF -κB的结合位点
假设NF-κB为CD47启动子的转录调控因子，则耐药细胞中NF-κB的活性与CD47的表达趋势是否一致？
Fig. 3A,B：启动子实验---体外耐药细胞中NF-κB活性较高（CD47高表达）
Figure 3C：WB---体外耐药细胞中p65（Ser536）和cytosolic p-IκBα(Ser32/36)上调
NOD/SCID mice：
核p65 (Ser536) 和胞质p-IκBα (Ser32/36) 的磷酸化：NF-κB激活
IκB：NF-κB从细胞质转位到细胞核的因子
3.4 NF-κB的水平变化影响CD47的表达
NF-κB与CD47的表达是否相关联？
激活NF-κB对CD47的影响？
- PLC/ PRF/5 和 Bel-7402细胞系：CD47低表达的HCC细胞系
- TNF-α激活NF-κB的表达
Fig. 4A：WB---20ng/mL的TNF-α成功激活NF-κB
Fig. 4B：FCA---20ng/mL TNF-α处理后的细胞表面CD47的表达升高
Fig. 4C：启动子实验---20ng/mL TNF-α处理后细胞的NF-κB的启动子活性升高，同时伴随着CD47启动子的活性升高
抑制NF-κB的表达对CD47的影响？
- MHCC97L 和 Huh-7细胞系：高表达CD47
-
NF-κB的抑制剂：IMD-0354
Fig. 4D：WB---3uM的IMD-0354可有效抑制NF-κB的表达
Fig. 4E：FCA---IMD-0354处理的细胞表面CD47的表达下降
Fig. 4F：启动子实验---IMD-0354处理的细胞中NF-κB和CD47的活性下降
Fig.4.png
3.5 NF-κB直接调控CD47的表达
NF-κB是否直接调控CD47表达？
Figure 5A：ChIP-qPCR assay---NF-κB与CD47启动子直接结合
Fig. 5B：TNF-α刺激，ChIp---NF-κB的结合位点的富集显著增加
Fig. 5C：IMD-0354抑制，ChIp---结合位点的富集显著减少
索拉菲尼耐药的细胞中NF-κB与CD47启动子的结合是否增加？
Fig. 5D/E： 索拉菲尼耐药的细胞中NF-κB与CD47启动子的结合显著增加
探究TI-Cs细胞中NF-κB调控CD47的反馈机制？
- 敲低CD47前后NF-κB上游分子（Akt和Erk）的表达变化
Fig. 3S：相比mock组，耐药 组细胞中磷酸化的Akt和Erk的表达明显较高；而耐药组细胞在敲低CD47后，磷酸化的Akt和Erk的表达下调，接近于mock组 - qPCR检测临床样本中NF-κB与CD47表达水平的相关性
NF-κB的表达与CD47显著相关R2=0.3659 - 过表达CD47与肿瘤包被缺失和微卫星的形成显著相关
结论：TI-Cs细胞中NF-κB对CD47的调控存在负反馈调节的机制
3.6 抑制NF-κB和CD47促进索拉菲尼致敏
假设：NF-κB介导的CD47表达上调导致索拉菲尼耐药
IMD0354抑制NF-κB
Fig. 6A：IMD0354剂量确定（Huh7：0.05uM，Bel-7402：0.5uM）
Fig. 5S：对照组与耐药组细胞抑制NF-κB的表达后，对索拉菲尼的敏感性增加
CD47 KD
Fig.6B：FAC---剂量10uM
Fig.6C：在高表达CD47的细胞系中（Huh7和MHCC97L），CD47敲低的细胞对索拉菲尼敏感增加
Fig. 6S：索拉菲尼耐药的细胞系中（Huh7和Bel-7402），CD47下调促进了索拉菲尼的致敏性
结论：CD47的表达水平是HCC对索拉菲尼敏感程度的关键因素
即然CD47对索拉菲尼敏感程度具有明显的影响效果，那么anti-CD47药物和索拉菲尼会不会逆转这种影响？
Fig.6D：高表达CD47的细胞----Huh-7和MHCC97L：2ug/mL的anti-CD47 Ab可以使Huh-7和MHCC97L对索拉菲尼致敏
Fig.7S：索拉菲尼耐药细胞---Bel-7402 cells（更为显著）：结果相同
结论：体外研究结果表明抗CD47 Ab的敏化作用与CD47 /信号调节蛋白α相互作用无关
3.7 PDTX模型联合anti-CD47和索拉菲尼联合用药对索拉菲尼敏化
Fig.7A$B：肿瘤体积---anti-CD47具有抗肿瘤作用
anti-CD47与索拉菲尼联合使用具有协同抗肿瘤作用
Fig.7C：血清T-IC标志物AFP含量---anti-CD47与索拉菲尼联合用药时，血清中AFP含量显著降低
索拉菲尼敏化是由于凋亡引起？
Fig. 7D：TUNEL---anti-CD47和索拉菲尼单独用药组凋亡细胞比例均有升高，二者联合用药凋亡细胞比例显著升高
4. 讨论
4.1 索拉菲尼耐药细胞Akt和mTOR信号通路处于激活状态
4.2 索拉菲尼耐药细胞瘤转移能力增强
4.3 索拉菲尼耐药细胞具有T-IC的特征：自我更新能力增强，侵袭能力，和肿瘤生成能力增强
4.4 CD47是肝T-ICs有效的靶点
4.5 CD47在索拉菲尼耐药细胞中普遍上调
4.6 探究CD47的表达调控机制--->UCSC Genome Browser--->CD47转录起始位点或有两个NF-κB的结合位点
4.7 ChIp实验和TNF-α（激动剂）与IMD-0354（抑制剂）验证NF-κB调控CD47的转录
4.8 NF-κB的激活通常发生在肝癌发生的早期，与炎症相关
4.9 索拉菲尼治疗后NF-κB的活性升高
4.10 NF-κB抑制剂IDM0354与索拉菲尼联合用药具有协同作用
4.11 CD47对于索拉菲尼耐药产生的影响--->慢病毒敲低CD47 & anti-CD47Ab--->索拉菲尼敏化--->考虑到在这些体外实验中未发现巨噬细胞，这些研究表明涉及CD47信号传导的巨噬细胞非依赖性机制可能与索拉非尼的致敏作用有关
