质粒是分子生物学研究的重要工具，犹如士兵手里的枪，其地位不言而喻。过去几十年的时间里，质粒在不同研究者之间传递，极大地推动了生命科学的研究进程。然而质粒经历了传递，改造，再传递的过程，再加上可能存在的突变（自发突变，酶保真性因素等等），我们手里拿到的质粒可能已经变得很"脏"。
就像下面这样，虽然可以运行，但也有可能在某一刻失灵，更为确切的说，像是一件修修补补的衣服，程序员看了都要砸了键盘。
言归正传，上链接，"Sorry，是案例"😋
文献：Zakataeva NP, Nikitina OV, Gronskiy SV, Romanenkov DV, Livshits VA. A simple method to introduce marker-free genetic modifications into the chromosome of naturally nontransformable Bacillus amyloliquefaciens strains. Appl Microbiol Biotechnol. 2010 Jan;85(4):1201-9. doi: 10.1007/s00253-009-2276-1. Epub 2009 Oct 10. PMID: 19820923.
在这篇文献中，作者构建了新的穿梭载体pNZT1，方法是将载体pKS1用 Eco32I 内切酶（平末端切口）消化后连接而成，剔除了kanamycin resistance gene。
载体pKS1图谱如下：
因为这个SnapGene自动注释并不完善，所以我们导入到plannotate中注释结构信息，得到如下图谱：
因此可以看出一些问题：
- 作者为了剔除Kanamycin resistance gene，简单的酶切去除部分Kan片段，所以有一部分残留序列(kanR fragment)。
- 序列中也残留 knt fragment、lacZ fragment、HA-R等，这是原始载体pKS1带来的。
在深挖pKS1原始文献[1]，发现其改造过程如下： pTV1-OK was digested by PstI and HindIII and the 1.3 kb fragment containing aphA3 (kanamycin resistance determinant of Enterococcus fecalis) was inserted between appropriate sites of pG-host9.
可以得出一些结论：
- 由于时代原因，技术水平相对落后低，采用限制性内切酶克隆的方法，不可能随心所欲地改造任意片段，这就导致了有意或无意残留一些"Scar Sequence"。现在无缝克隆早已摆脱了内切酶的限制。
- 作者可能也没有意识到的一些片段的作用。
也许有人会觉得过于吹毛求疵，那么请看pHT01载体改进的原始文献[2]
"During the use of these two vectors, we detected structural instability after transformation of these vectors in E. coli. A close inspection of the DNA sequence of these vectors revealed a 117-bp direct repeat already present within the original shuttle cloning vector pNDH33"
那么，如何查看自己所获取的质粒完整结构信息呢，参看文章如何获取质粒上的特征元件
流程如下：
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Shatalin KY, Neyfakh AA. Efficient gene inactivation in Bacillus anthracis. FEMS Microbiol Lett. 2005 Apr 15;245(2):315-9. doi: 10.1016/j.femsle.2005.03.029. PMID: 15837388. ↩
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Nguyen HD, Phan TT, Schumann W. Expression vectors for the rapid purification of recombinant proteins in Bacillus subtilis. Curr Microbiol. 2007 Aug;55(2):89-93. doi: 10.1007/s00284-006-0419-5. Epub 2007 Jul 11. PMID: 17624574. ↩
