Single-cell sequencing in stem cell biology
在哺乳动物早期胚胎中只有少量多能干细胞；组织特异性干细胞通常只有少量存在于特殊的组织和器官中。这些少量的细胞中存在许多分化和中间状态的细胞类型（不同细胞类型和亚群），单细胞测序是鉴定这些细胞异质性的有力工具。
单细胞RNA测序技术
单细胞RNA测序技术介绍
目前，已经有大量的单细胞测序技术被开发利用，如Smart-seq/Smart-seq2【6，7】、STRT-seq【9，10】、MARS-seq【20】等。原位单细胞RNA测序及高通量测序技术【24、25】、单细胞层面的三维重构RNA-seq技术【26-28】也已被建立。以上技术均只能捕获具有polyA尾的RNA，而SUPeR-seq技术可同时检测无polyA尾及有polyA尾的RNA【32】。Drop-seq和inDrop采用了ne-bead–one-cell droplet and an unique barcoding策略，将测序通量提升至一次1k-1w细胞【22，23】。
已有相当数量的生物信息学软件被应用于单细胞测序数据的分析，相关文献对这些方法进行的深入的讨论【35】。其中，Monocle及Waterfall对单细胞数据进行为时间序列分析【38，39】
目前scRNA-seq的技术在捕获率和扩增等方面仍具有相对较高的技术噪音。但在研究高差异表达基因并且掩盖这些差异的基因表达水平较低的情况下是可以容忍的。科学家已优化逆转录和PCR等流程，如使用微流控系统【18，19】、UMIs【10，33】、spike-in【42】作为标签等。
文中还提及其相关应用，可参考相关文献：early mammalian embryos [43–48], developing tissues[33, 49–51], adult tissues [22, 36, 37, 52, 53], immune cells [20, 21, 54–56], cancer cells [6, 57–59], and stem cells that are either isolated in vivo [39, 60–63] or cultured in vitro [23, 38, 64–67].
文章接下来介绍scRNA-seq在多能干细胞胚胎植入前发展、胚胎干细胞、原生殖细胞、组织特异性干细胞等方面运用，本笔记重点关注除上述方面的内容
大体流程
实验设计：1、目标细胞的大小(是否大于3um)；2、分离单细胞的方法；3、估计目标细胞群的异质性程度；4、目标细胞是否需要FACS或MACS富集；
实验执行：1、避免交叉污染；2、避免RNA降解；3、设置阳性对照以确保试剂的有效性和流程的可信度；4、设置阴性对照以确保没有系统污染；5、随机分组样本以避免批次效应；6、对qRCR产物进行质控；7、确保使用目标细胞进行测序；8、决定每个样本的测序深度
生信分析：1、对测序结果进行质控；2、选择合适软件进行亚群鉴定/时空表达分析；3、使用合适数据分析工具鉴定差异表达基因
结果验证：1、以合适方案证明所发现基因表达模式；2、进行功能分析进一步探索
组织特异性干细胞
组织特异性干细胞存在于发育或分化中的组织。它们同样有着自我更新和分化能力。已有研究鉴定了新的干细胞类型并且在“同质”细胞群中剖析其中的细胞异质性。
干细胞新类型的鉴定
Treutlein等利用scRNA-seq对发育中的小鼠上皮细胞进行测序，识别除出新的细胞类群，并重构出揭露转录组动态的分化时序过程【49】。
干细胞群体内异质性分析
这些研究揭示在不同组织的干细胞群在结构上的异同。Kowalczyk等【60】和Tsang等【61】通过scRNA-seq发现细胞周期差异掌控着造血干细胞的细胞异质性；Shin等【39】和Llorens-Bobadilla等【63】通过伪时间序列的概念描绘了早期神经生产过程的发育规矩。
非正常生理性条件下干细胞细胞群的变化也是研究热点之一。Llorens-Bobadilla等【63】分析了缺血性脑损伤组织中的神经干细胞，发现在损伤与正常生理条件下的细胞群体组成具有显著差异；Kowalczyk等【60】比较了衰老和青年小鼠并发现LT-HSCs的G1期时长缩短，此外，他们发现衰老小鼠的HSCs的转录状态与其分化状态反向相关，如衰老 ST-HSCs与正常LT-HSCs相似。
单细胞表观遗传测序
干细胞的发展、维持、分化都是由包括DNA、组蛋白共价修饰的基因表观遗传修饰控制的。潜藏在干细胞转录组异质性中的表观基因组异质性自然而然引起了研究者们的兴趣。目前，这些异质性如何与染色质结构改变项=相联系还不得而知（？胞生中提及）。传统的全基因组表观遗传检测需要上百万的细胞并且不能鉴定细胞个体间的差异。
DNA甲基化修饰
DNA甲基化是哺乳动物中最主要的DNA修饰并且在发育过程中起着重要的作用。目前，scRRBS【77】、scBS-seq【75】、scWGBS【76】等已被科学家用于单细胞DNA甲基化测序。已有研究展示了哺乳动物预植入（mammalian pre-implantation ）、PCGs发育是的全局DNA甲基化变化【80-82】。除了DNA甲基化，最近的研究还发现了羟甲基化(5hmC)以及5-甲酰基胞嘧啶(5fC)和5-羧基胞嘧啶(5caC)对基因组DNA的修饰【83】。应用于单细胞水平的DNA修饰检测仍有待改进。
染色质开放性和结构
单细胞染色质开放性检测、结构检测技术也被科学家们相继运用以研究【85-88】。这些技术可以用于鉴定干细胞所处的不同染色质状态【86】，在不远的未来可以未剖析干细胞群内染色质状态的异质性。
组蛋白修饰
组蛋白修饰在干细胞调控基因表达过程中起着极大的作用。 ChIP-seq是全基因组组蛋白修饰测定的常用方法。Rotem等将Chip-seq与微珠及标签策略结合(Drop-ChIP)进行单细胞层面的组蛋白修饰研究【89】，效果尚可。
单细胞基因组测序：略
讨论
单细胞测序技术目前还不够理想，仍存在着显著的技术噪音、扩增失误以及相较于普通测序更低的覆盖度（low coverage）。作者认为单细胞测序的发展应从测序技术和生信分析手段两方面改进。<举例了PCR层面的改良尝试，见原文>作者提出未来单细胞测序技术应该能满足对单细胞裂解产生的原始核酸拷贝进行多次重复测定。作者指出目前的伪时间序列分析在解决分化中的中间状态分析上有一定的缺陷，尤其是当细胞早期和后期状态显著不同时。（个人：应该是指全表达谱层面来看的，若挑取显著差异表达基因可能改善该情况）。此外，作者认为可以通过提高采样密度（一小时一次）来解决测序反映瞬时细胞状态的问题。后期分化时间点可能含有分化延迟的细胞在内这一点假设对于假时间算法有一点意义。
多组学联合分析也是未来发展的重点之一。目前，单细胞转录组+基因组(G&T-seq)【103】, 单细胞转录组+DNA甲基化(scM&T-seq) 【104】, 单细胞转录组+基因组+DNA甲基化(genome, DNA methylome, and transcriptome; scTrio-seq) 【73】。
良好的多组学分析可用于重建体内干细胞的发育谱系，转录组数据可用于鉴定新的细胞类型或亚群；表观遗传信息也可被用于探究不同表观遗传状态如何影响转录；最终厘清基因型与表型间的因果关系。
作者最终展望：Single-cell multiple omics sequencing at serial time points during the development and differentiation process of stem cells could then be used to reconstruct the core gene regulation network within each individual cell during the differentiation process. The phenotype–genotype relationship for each gene within each individual cell, or between different individual cells, will finally permit us to understand thoroughly the complexity and beauty of the gene regulation network under both physiological and pathological conditions, and will provide us with new insights into the biological basis of human development and diseases.
