梁蛋蛋

@冻春卷 春卷菌，我又来了，细胞算是养起来了，做了WB背景是干净的，CCK8也显示和WT增殖无统计学差异，我终于差不多要开始正式实验了

CRISPR-Cas9基因编辑6--挑单克隆技术哪家强

前言： 挑选到满意的sgRNA之后，就要开始正式实验，而正式实验中细胞转染部分我则不会再讲，直接到最关键的部分：挑取单克隆。 实验正文 1. 实验准备 常规试剂、仪器：转染试...

冻春卷

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梁蛋蛋

@冻春卷 还是改成6孔板了，春卷菌，直接一个基因一块6孔板

CRISPR-Cas9基因编辑6--挑单克隆技术哪家强

前言： 挑选到满意的sgRNA之后，就要开始正式实验，而正式实验中细胞转染部分我则不会再讲，直接到最关键的部分：挑取单克隆。 实验正文 1. 实验准备 常规试剂、仪器：转染试...

冻春卷

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梁蛋蛋

@冻春卷 是的，看着细胞间的连接已经变很远了，我索性换成了6孔板，但是感觉不同基因的在一个板子又怕弄混，现在换成了6cm皿，希望能好一点，按道理此前能够单克隆化，应该会存活才对呀，都21天了，还没能继续往下做实验，一直在养细胞。

CRISPR-Cas9基因编辑6--挑单克隆技术哪家强

前言： 挑选到满意的sgRNA之后，就要开始正式实验，而正式实验中细胞转染部分我则不会再讲，直接到最关键的部分：挑取单克隆。 实验正文 1. 实验准备 常规试剂、仪器：转染试...

冻春卷

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梁蛋蛋

@冻春卷 春卷菌，我又来了，我的单克隆有了，但是现在扩大到T25总是长得非常非常非常慢，而且压根长不满，不知道有没有什么好办法可以解决这个问题呢？目前已经用上20%GIBCO FBS了，其他的不是GIBCO的，培养瓶那些也不是corning的，不知道这些有没有什么影响呢？

CRISPR-Cas9基因编辑6--挑单克隆技术哪家强

前言： 挑选到满意的sgRNA之后，就要开始正式实验，而正式实验中细胞转染部分我则不会再讲，直接到最关键的部分：挑取单克隆。 实验正文 1. 实验准备 常规试剂、仪器：转染试...

冻春卷

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梁蛋蛋

@冻春卷 不呢，RD和293T只是拿来练手用😅。春卷菌，96孔板的好坏是不是也会影响到单细胞的存活呢？

CRISPR-Cas9基因编辑6--挑单克隆技术哪家强

前言： 挑选到满意的sgRNA之后，就要开始正式实验，而正式实验中细胞转染部分我则不会再讲，直接到最关键的部分：挑取单克隆。 实验正文 1. 实验准备 常规试剂、仪器：转染试...

冻春卷

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梁蛋蛋

@冻春卷 感谢春卷菌，我现在试了RD，293T和FHC，都不怎么活，很头大

CRISPR-Cas9基因编辑6--挑单克隆技术哪家强

前言： 挑选到满意的sgRNA之后，就要开始正式实验，而正式实验中细胞转染部分我则不会再讲，直接到最关键的部分：挑取单克隆。 实验正文 1. 实验准备 常规试剂、仪器：转染试...

冻春卷

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梁蛋蛋

@冻春卷 害呀，那么久了还是没有成功，挑选后单细胞不长了就死了，然后6月1重新又挑了

CRISPR-Cas9基因编辑6--挑单克隆技术哪家强

前言： 挑选到满意的sgRNA之后，就要开始正式实验，而正式实验中细胞转染部分我则不会再讲，直接到最关键的部分：挑取单克隆。 实验正文 1. 实验准备 常规试剂、仪器：转染试...

冻春卷

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梁蛋蛋

@冻春卷 好的好的，感谢春卷菌，等我回趟家回来把铺好的96孔板里的细胞用枪头挑到新板子里试一下

CRISPR-Cas9基因编辑6--挑单克隆技术哪家强

前言： 挑选到满意的sgRNA之后，就要开始正式实验，而正式实验中细胞转染部分我则不会再讲，直接到最关键的部分：挑取单克隆。 实验正文 1. 实验准备 常规试剂、仪器：转染试...

冻春卷

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梁蛋蛋

春卷菌，我又来了，今天试了下消化后稀释到10^3个/ML，然后取100ul加到20ml后取200ul至96孔板，2h后去看发现每个孔里面哪只1个😭，如果是不带荧光的细胞，方法三操作性怎么样呢？太难了这操作

CRISPR-Cas9基因编辑6--挑单克隆技术哪家强

前言： 挑选到满意的sgRNA之后，就要开始正式实验，而正式实验中细胞转染部分我则不会再讲，直接到最关键的部分：挑取单克隆。 实验正文 1. 实验准备 常规试剂、仪器：转染试...

冻春卷

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梁蛋蛋

@冻春卷 感谢春卷菌！我后续需要用到这个细胞做类器官，小老板让挑单克隆。那等我今天传代的两孔长好我还是最佳浓度去养他们，再养个一周就挑试一下。从去年就看春卷菌的简书，受益匪浅！后面疫情走读生不让进校不了了之，今年2月中旬才开始做实验，每天的实验少但过程真是漫长！后续有问题继续请教春卷菌，再次感谢！

CRISPR-Cas9基因编辑7--测序验证敲除

前言： 使用挑单克隆技术得到多个单克隆细胞系后，就要开始验证敲除，除了蛋白表达水平的检测，最终还是要看测序结果。关于测序的方案也是各有不同，由于之前选用的是CRISPR-Ca...

冻春卷

29117 97 40

梁蛋蛋

@冻春卷 感谢春卷菌！我后面思索了下应该要包含sgRNA在内的拟敲除基因序列的上下500bp，看到文献多是500bp上下的PCR产物，又有指出600-700bp较好，我选择了后者，这点不知道春卷同学是否有更好的指导呢？目前还在多克隆阶段，有文献指出，对照细胞死亡后，以1/4-1/2最佳puro浓度继续筛选3周，也有文献说对照死亡后待细胞状态良好后继续最佳puro浓度加压筛选20天。我现在以不到1/2最佳puro浓度继续筛选了11天了，长很满，今早一个孔传了两个孔，计划是一个孔先冻一点，另外一个孔传代24h后继续不到1/2最佳puro浓度筛选下去，直到汇合度80以上后开始单克隆的挑选了，不知是否合适。希望春卷菌能指导下，再次感谢！

CRISPR-Cas9基因编辑7--测序验证敲除

前言： 使用挑单克隆技术得到多个单克隆细胞系后，就要开始验证敲除，除了蛋白表达水平的检测，最终还是要看测序结果。关于测序的方案也是各有不同，由于之前选用的是CRISPR-Ca...

冻春卷

29117 97 40

梁蛋蛋

春卷同学，打扰了，有个问题想要请教下，挑完单克隆后的PCR扩增中的引物我看文献是说以sgRNA为中心上下500bp去设计引物，这里包括sgRNA那一段在里面么？还是说跳开sgRNA，只拿它的上下500bp设计引物呢？PCR产物送测的时候按你在评论说的，拿这个PCR单边引物给公司测序就好么？期待回复！再次感谢！

CRISPR-Cas9基因编辑7--测序验证敲除

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冻春卷

29117 97 40

梁蛋蛋

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梁蛋蛋

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